PI3K/mTOR信号通路参与调控舌鳞状细胞癌上皮间质转化的实验研究

【摘要】：目的 头颈部恶性肿瘤大约90%为鳞状细胞癌,其中舌鳞癌是头颈部鳞癌中最常见的。舌鳞癌患者往往在诊断时就已发生扩散,并以局部淋巴结转移为主旦发生局部淋巴结转移,患者的生存率将会下降约50%。上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)发生在肿瘤的发生发展过程中,同时能够提高细胞的运动和侵袭能力。1.检测舌鳞癌组织中PI3K/mTOR信号通路和EMT相关蛋白的表达情况；2.在Tb3.1细胞中通过诱导细胞发生EMT后Akt、mTOR蛋白和EMT相关蛋白的表达情况；3.研究PI3K/mTOR信号通路是如何参与舌鳞癌细胞发生EMT的过程。 方法 1.检测Akt, mTOR和E-cadherin, β-catenin和Vimentin蛋白在舌鳞癌组织中的表达。取41例舌鳞癌淋巴结阳性组织标本作为实验组,41-例舌鳞癌淋巴结阴性组织标本作为对照组。①免疫组化法研究Akt, mTOR和E-cadherin, β-catenin和Vimentin蛋白在41例舌鳞癌淋巴结阳性组织中和41例舌鳞癌淋巴结阴性组织中的表达水平：②探讨PI3K/mTOR通路蛋白和EMT蛋白与舌鳞癌.淋巴结转移的关系。 2.常规培养人舌鳞状细胞癌Tb3.1,取对数生长期的细胞进行实验,将细胞将细胞以2×109/L接种六孔板中待细胞贴壁后加入无血清DMEM/F12,然后分别加入EGF0、5、10、20、40ng/ml,在0h、24h、48h分别于倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。实验共分五组：①空白对照组；②20ng/ml EGF组；③20ng/ml EGF+200nM/L Rapamycin组；④20ng/ml EGF+20μM/L LY294002组；⑤20ng/ml EGF+200nM/L Rapamycin+20μM/L LY294002组。使用倒置显微镜观察加入抑制剂后Tb3.1细胞的形态变化；划痕实验检测加入抑制剂后Tb3.1细胞迁移能力；蛋白质印迹法检测加入抑制剂后Tb3.1细胞的E-cadherin、 β-catenin、Vimentin、P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白的表达；免疫荧光实验检测加入抑制剂后E-cadherin、β-catenin、Vimentin的表达情况。 结果 1.在41例舌鳞癌淋巴结阳性组织中,33例表达Akt(80.5%),30例表达mTOR(73.2%),7例表达E-cadherin(17.1%),11例表达(3-catenin(26.8%),34例表达Vimentin(82.9%)；在41例舌鳞癌阴性淋巴结组织中,10例表达Akt(24.4%),13例表达mTOR(31.7%),26例表达E-cadherin(63.4%),27例表达β-catenin (65.9%),8例表达Vimentin (19.5%),经统计学分析这五种蛋白在舌鳞癌阳性和阴性淋巴结组织中的表达差异均有统计学意义(P0.05)。 2.划痕实验显示EGF处理的细胞迁移能力增强,加入Rapamycin和(或)LY294002后细胞的迁移能力减弱；蛋白印迹结果显示EGF处理的细胞Vimentin、P-Akt和P-mTOR的表达增加,E-cadherin和β-catenin的表达减少,用Rapamycin和LY294002处理后,细胞不在受EGF的影响；不同浓度EGF处理细胞48h后,20ng/ml和40ng/ml EGF组的Tb3.1细胞变成长梭形,其中20ng/ml EGF组Tb3.1细胞开始变成长梭形。Rapamycin和LY294002联合应用时细胞的形态恢复为上皮性；免疫荧光显示EGF能够使E-cadherin几乎不表达,β-catenin进入核内,Vimentin表达增加,而Rapamycin和LY294002能够不同程度的影响这些蛋白的表达,并且二者的联合作用更明显。 结论 1.在舌鳞癌淋巴结阳性组织中存在PI3K/mTOR通路的激活以及EMT现象的发生 2. EGF能够诱导舌鳞癌细胞发生EMT,表现为E-cadherin和β-catenin表达下降,Vimentin表达增加,同时细胞的迁移能力增加； 3.P13K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin能够抑制舌鳞癌细胞EMT的发生； 4.舌鳞状细胞癌发生EMT可能是通过PI3K/mTOR信号通路实现的； 5.通过激活PI3K/mTOR信号通路从而引起舌鳞癌细胞发生EMT的改变,从而发生一系列的变化,这一通路有可能成为治疗头颈鳞癌的一条新途径,具有广泛的应用前景。