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亚低温联合促红细胞生成素(EPO)对颅脑创伤后β-淀粉样蛋白(Aβ)表达影响的体内体外研究

方佳  
【摘要】:目的:拟通过检测p-淀粉样蛋白(Aβ)在临床颅脑创伤(TBI)患者体液中表达量的改变,证实其参与TBI的进展;构建pIRES2-EGFP-APP重组表达质粒,转染SH-SY5Y-APP细胞,构建稳定表达Aβ的细胞模型,采用亚低温干预手段,证实该措施对细胞创伤起一定程度的保护作用;在此基础上回归体内试验,常规建立液压颅颅脑创伤模型,除给予亚低温保护性干预外,应用促红细胞生成素(EPO)及其与亚低温联合干预,观察治疗效果,寻找颅脑创伤的新的治疗靶点,为临床早期干预寻找新的方向。 方法:本课题分为三部份,第一部分:通过对60例小样本的临床病例进行检测,分别于患者入院后第0h、24h、48h、72h留取CSF、外周血,ELISA方法检测Aβ含量,并采用GCS评分标准判断预后评估,检测Aβ在脑脊液及血清中的变化与预后的相关性。第二部分:构建pIRES2-EGFP-APP重组表达载体,常规培养SH-SY5Y细胞系,细胞状态稳定后进行转染,western-blot方法检测细胞蛋白中APP是否表达及表达量高低,构建稳定表达APP的细胞模型;并在此基础上给予常温及亚低温培养,检测不同温度条件下细胞生长情况。第三部分:制备液压颅颅脑创伤模型,大鼠造模结束后采用冰袋包裹头部以下部位,30分钟内将体温降至31℃保持温度波动于31-33℃,5小时;其后将体温升至37.5-38.5℃。rhEPO组大鼠致伤后即刻及每天腹腔内注射(5000IU/kg) rhEPO,术后每12h肌注青霉素钠40万U。分别于手术后0.5h、2h、6h、12h、24h、48h、72h, ELISA方法检测血清及脑脊液中Aβ含量,病理检查观察TBI模型脑组织创伤情况,western-blot检测不同干预方式脑组织中Ap表达。 结果:第一部分实验通过对小样本的临床病例的体液标本进行检测,发现颅脑创伤患者术后Aβ随时间改变逐步升高,其机制涉及颅颅脑创伤可致神经元、胶质细胞创伤,血脑屏障破坏,进而使得崩解的细胞骨架中的Aβ进入脑脊液及血液循环,其表达水平与创伤程度呈正相关。第二部分的研究结合临床检验的结果,选用真核表达载体pIRES2-EGFP来转染SH-SY5Y细胞系,基于细胞标记示踪理论依据,并借助该实验手段对细胞株进行反复筛选,从而获得稳定转染并大量表达APP的细胞系。通过Western-blot进一步证明了APP基因在转染细胞系内稳定表达。并给予细胞株常温培养及亚低温培养两种不同的干预措施,证实亚低温对细胞创伤起一定程度的保护作用。第三部分进行了体内模型的构建和研究,成功构建了大鼠液压冲击颅颅脑创伤模型,通过神经系统评分鉴定了模型的可行性,在此基础上分别给予亚低温、EPO、及两者联合干预治疗的方式,证实亚低温联合EPO可有效保护颅脑创伤后大脑功能的改变,为进一步深入展开创伤性颅脑的治疗提供新的治疗靶点及理论依据。 结论:在常规治疗的同时,采用亚低温治疗可抑制重型颅颅脑创伤患者的Aβ的表达及ICP水平并提高患者预后,Aβ作为一种新生物标记物,其动态变化与颅颅脑创伤创伤程度有一定相关性,Aβ含量变化作为患者预后一项评定指标。


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