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Jak2的缺失通过减弱Raf-1/MEK1/Sp-1信号通路并eNOS及STAT活性损伤内皮功能

张亚文  
【摘要】:目的: 本研究旨在探讨Jak2在保持血管内皮稳态中的作用及其缺陷对内皮功能的影响。由于Jak2缺陷会导致胚胎期死亡,目前对Jak2在保持内皮稳态作用的研究多采用Jak2抑制剂,然而Jak2在出生后内皮功能调节中的确切机制却并不明了。在本研究中,我们用了tamoxifen(他莫昔芬)诱导的成年Jak2敲除小鼠模型。利用这种基因敲除模型,我们检测了胸主动脉收缩舒张能力。利用基质胶栓比较了Jak2基因敲除对内皮血管生成的影响。之外,我们还创建了小鼠后肢缺血模型以探索Jak2在缺血后血管再生、血流恢复中的作用。鉴于Jak2在内皮功能以及血管再生中所起的作用,我们对相应的机制进行了探索,以期对Jak2在内皮稳态中所起的作用有更深的理解,而且对以Jak2为基础的临床治疗及研究提供更多的方法和手段。 方法: 1.研究Jak2基因敲除小鼠血管内皮功能及其在血管再生中的作用 (1)Jak2基因敲除小鼠模型:Jak2fl/fl与Cre-ERT2转基因小鼠杂交生成Cre+-Jak2fl/fl小鼠。在本研究中,只采用了雄性小鼠。在8周时,对Cre+-Jak2fl/fl小鼠连续5天皮下注射他莫昔芬(25mg/kg体重)诱导Jak2基因敲除。 (2)在Jak2基因敲除及对照小鼠中,我们检测了胸主动脉的收缩、舒张功能;利用基质胶栓方法测定了血管生成情况,通过测定基质胶栓中血红蛋白含量及CD31染色比较Jak2敲除小鼠及对照鼠血管生成的区别;除此之外,我们还对后肢血管结扎的Jak2敲除小鼠及对照小鼠血流恢复情况进行了比较,收集缺血的下肢组织进行了CD31免疫荧光染色。 2.研究Jak2基因敲除小鼠血管内皮功能损伤及血管再生能力减弱的机制 (1)从Jak2基因敲除及对照小鼠主动脉提取蛋白,定量后进行Western Blot探测STAT家族蛋白,eNOS, p-eNOS, MEK1, p-MEK1, AKT, p-AKT, ERK1/2, p-ERK1/2, p38及p-p38的表达水平。采用免疫共沉淀的方法,在主动脉蛋白裂解液中检测转录因子Sp-1的表达水平。 (2)培养猪主动脉内皮细胞,用TNFa及PD89059(MEK1抑制剂)或者AZD1480(Jak2抑制剂)对细胞进行处理后测定Raf-1, pRaf-1, MEK1, pMEK1,Sp-1,pSp-1表达水平的变化。并采用电泳迁移率实验(EMSA)在经过以上处理的细胞中检测Sp-1对eNOS启动子区结合力的变化。 结果: 1.Jak2缺陷对血管内皮功能及新生血管生成的影响 (1)Jak2功能缺失损伤了内皮依赖的血管舒张:与对照小鼠相比,Jak2基因敲除小鼠胸主动脉对有赖于内皮的血管舒张剂的反应减弱。 (2)Jak2的缺陷损伤了血管再生的能力:基质胶栓实验显示对照小鼠的血红蛋白含量是Jak2基因敲除小鼠的3.3倍(0.99±0.2μg/mg gel vs.0.23±0.1μg/mg gel,P0.001)。免疫荧光染色显示在Jak2缺陷小鼠中CD31阳性的细胞数以及管状结构相比对照小鼠都要少。 (3)Jak2缺失减慢了后肢缺血创伤后新生血管的生成及血流的恢复:后肢缺血手术后,Jak2基因敲除小鼠的血流恢复比对照小鼠明显慢。对缺血后下肢肌肉组织进行免疫荧光染色显示,CD31阳性及α-actin阳性细胞数量在Jak2缺陷小鼠明显低于对照小鼠。 2.Jak2缺失损伤内皮功能及血管生成的机制研究 (1)Jak2缺失降低了eNOS, AKT的表达:Western Blot结果表明在Jak2缺陷的小鼠主动脉中,eNOS, p-eNOS及AKT, p-AKT表达量明显低于对照小鼠。 (2)Jak2缺失影响了Raf1/MEK1信号传导通路并减弱了Sp-1的活性:Western Blot及免疫共沉淀表明Jak2基因敲除小鼠中Raf1/MEK1信号通路中的蛋白表达减少。EMSA显示Sp-1的活性在Jak2基因敲除小鼠中是降低的。 (3)Jak2缺陷导致了STAT信号通路的改变:Jak2基因敲除小鼠主动脉STA3, STAT5及STAT6表达水平下降,协同了RAF1/MEK1对血管生成的负面影响。 结论: Jak2基因的缺失导致了血管内皮的功能不良,表现在内皮依赖的血管舒张功能的受损,血管再生能力的下降以及后肢缺血损伤后血流恢复的减慢。 Jak2缺失导致的内皮功能受损及血管再生能力的下降是由于Raf1/MEK1/Sp-1/eNOS这条信号传导通路受到了影响。此外,STAT3, STAT5和STAT6的水平在Jak2基因敲除小鼠主动脉的表达量降低,协同了Raf1/MEK1/Sp-1/eNOS信号通路对内皮功能的影响。我们的研究不仅对于理解Jak2在出生后内皮功能的调节中的确切机制提供了有意义的证据,而且对于临床基于Jak2为治疗手段的心血管疾病提供了更广阔的治疗及研究手段。


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