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基于普鲁兰多糖的纳米药物递送系统靶向抗肝癌作用研究

刘媛媛  
【摘要】:目的:原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,且有逐年上升趋势。化疗是治疗肝癌的常用方法之一,然而大部分肝癌易对化疗药物产生多药耐药性,从而严重限制了其在临床上的应用。因此,探索有效的肝癌治疗策略意义重大。普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵产生的水溶性多糖,具有许多优良的生物学性质,还是肝癌细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的天然配体,可以用作肝癌靶向载体材料。本研究构建了两种基于普鲁兰多糖的肝癌靶向纳米共载体系,用于不同作用机制的抗肿瘤药物或基因与化疗药物的有效共载,以期联合多种治疗方法实现对肝癌的高效作用。研究方法:第一部分:合成p H敏感的普鲁兰多糖衍生物URPA;将抗肿瘤药物甲氨蝶呤(MTX)以酯键与URPA偶联,形成高分子前药MTX-URPA;采用红外光谱(IR)与核磁共振氢谱(1H NMR)对URPA与MTX-URPA进行化学结构表征。利用自组装技术制备MTX-URPA前药型纳米粒;将抗血管生成药物康普瑞汀(CA4)物理包埋于MTX-URPA纳米粒;采用透射电镜(TEM)观察纳米粒的形貌;采用动态激光散射法检测其粒径;采用Zeta电位测定仪考察其表面荷电性质;采用紫外分光光度法(UV)考察纳米粒的载药能力。利用MTT法检测载药纳米粒对肝癌Hep G2细胞的毒性,并通过流式细胞术检测其在细胞中的摄取量。构建裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,采用高效液相色谱法(HPLC)考察尾静脉注射给药后荷瘤小鼠体内MTX与CA4的血药浓度与组织分布及其肿瘤生长情况与肿瘤组织中血管密度,综合评价该纳米共载体系的抗肿瘤活性。第二部分:通过迈克尔加成反应合成聚氨基酯PBAE。以绿色荧光蛋白质粒(p EGFP)为模型基因,制备PBAE/p EGFP纳米复合物;采用琼脂糖凝胶电泳考察两者的复合情况,确定最佳PBAE/p EGFP质量比。将MTX通过酯键与普鲁兰多糖偶联形成高分子前药MTX-PL,采用IR与1H NMR技术对其进行化学结构表征,采用UV法检测前药分子中MTX的含量。将MTX-PL吸附包裹于PBAE/p EGFP纳米复合物的表面,形成亲水多糖外壳,制备纳米共载体系。采用TEM观察纳米体系的形貌;采用动态激光散射法检测其粒径与粒径分布;利用Zeta电位测定仪考察其表面荷电性质。采用激光共聚焦显微镜与流式细胞术考察纳米共载体系对Hep G2细胞的亲和性以及p EGFP在细胞中的转染效率;采用CCK-8试剂盒检测纳米共载体系的细胞毒性;通过小动物活体成像技术观察纳米共载体系在Hep G2荷瘤小鼠体内的分布,评价其对肝癌的靶向作用。结果:第一部分:成功合成了URPA,其中尿刊酰基取代度为5.2%。URPA具有显著的p H敏感性,响应p H值为6.5。MTX高效偶联于URPA多糖骨架,形成高分子前药MTX-URPA;MTX的含量约为17.8%。成功制备了球状形态的MTX-URPA纳米粒,平均粒径为187.1 nm;该纳米粒表现出对肝癌Hep G2细胞的高亲和性。CA4被包载于MTX-URPA纳米粒中,表现出显著的p H敏感体外释药特征。体外及动物体内实验均显示该纳米共载体系能够实现两种治疗剂的有序释放,并有效蓄积于肝癌PLC/PRF/5荷瘤小鼠的肿瘤病灶,还具有显著增强的抑瘤效应与肿瘤血管生成抑制作用,有利于对肝癌的靶向联合治疗。第二部分:成功合成了PBAE与MTX-PL,并对其化学结构进行了表征;MTX-PL分子中MTX的含量约为15.2%。PBAE表现出对p EGFP高效的复合压缩能力;制备PBAE/p EGFP纳米复合物的最佳质量比为50/1。MTX-PL成功包覆于基因纳米复合物的表面,形成具有“核壳结构”的MTX-PL/PBAE/p EGFP纳米粒,从而实现了基因与化疗药物的有效共载。共载纳米粒的平均粒径为172.9 nm,分布较均匀,表面呈电中性。通过纳米共载体系的携载,实现了p EGFP在Hep G2细胞中的高效转染以及对肝癌细胞生长的显著抑制。尾静脉注射给药后24 h,MTX-PL/PBAE/p EGFP纳米粒主要分布于Hep G2荷瘤小鼠的肿瘤组织,具有较好的肝癌靶向性。结论:本研究设计并构建了两种基于普鲁兰多糖的肝癌靶向纳米药物或基因/药物共载体系。一种是携载血管生成抑制剂与化疗药物的纳米共载体系,实现了对两种不同作用机制药物的肝癌靶向递送以及高效的抗肝癌协同作用。另一种是携载基因(模型)与化疗药物的纳米共载体系,实现了基因与药物的高效共载、细胞水平的协同作用以及动物体内的肝癌靶向递送。这两种纳米共载体系的构建有利于对肝癌的联合治疗,为解决临床肝癌治疗难题提供了新的策略。


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