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IL-37b基因修饰的骨髓间充质干细胞对DSS诱导的肠炎缓解作用的研究

王伟强  
【摘要】:目的白介素37b(IL-37b)具有显著的免疫抑制功能,骨髓间充质干细胞(MSC)对炎症性肠病具有缓解作用并且是理想的外源基因表达载体。本研究的目标是观察IL-37b基因修饰的小鼠MSC对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的炎症性肠病小鼠模型的缓解效果并探讨发挥作用的机制。方法实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫组化检测溃疡性结肠炎病人的病变肠组织中IL-37基因的m RNA和蛋白表达情况。构建表达IL-37b基因的腺病毒载体。C57BL/6小鼠致密骨片中分离培养MSC,流式细胞仪鉴定MSC表面标记分子,油红O和von Kossa染色鉴定MSC成脂成骨分化潜能。携带IL-37b基因的腺病毒转染MSC后RT-PCR、western blot和ELISA鉴定IL-37b在MSC中的表达。C57BL/6小鼠饮用3%DSS连续8天,制备炎症性肠病小鼠模型。在给于3%DSS的第一天,将小鼠随机分为MSC-IL37b组(腹腔注射转染IL-37b基因的MSC),MSC-e GFP组(腹腔注射转染对照病毒的MSC),MSC组(腹腔注射未转染病毒的MSC)和PBS组(腹腔注射PBS)。每日记录小鼠体重和大便情况,第10天处死小鼠,取结肠,测量结肠长度,HE评估结肠炎症严重程度;取小鼠脾脏,流式细胞仪分析脾脏单个核细胞中髓系来源抑制性细胞(MDSCs,CD11b+Gr1+)和CD4+T细胞中调节性T细胞(Tregs,CD4+CD25+Foxp3+)比例,细胞内因子染色(ICS)分析CD4+和CD8+T细胞炎症因子表达情况。结果IL-37基因在溃疡性结肠炎病人的病变组织中表达明显增高,且其蛋白表达水平随炎症程度的增加而增加,提示其参与了整个疾病进展过程。培养至P3时超过95%细胞表达典型的MSC表面标记分子,且能成功分化为成脂和成骨细胞。IL-37b基因修饰的MSC分泌性表达IL-37b蛋白(13.03±1.023 ng/ml)。第10天处死小鼠,结果显示:MSC-IL37b组的体重减少程度显著低于PBS组(85.74±2.01%vs.73.85±2.18%,P0.05),PBS组与MSC组或MSC-e GFP组相比,体重减少趋势更明显,但无统计学差异(73.85±2.18%vs.80.36±2.28%P=0.07;73.85±2.18%vs.77.38±2.21%,P=0.28);MSC-IL37b组(5.733±0.1706 cm)的平均结肠长度显著高于PBS组(4.375±0.2287 cm,P0.001)、MSC组(5.117±0.1078 cm,P0.05)和MSC-e GFP组(4.967±0.1333 cm,P0.01),MSC组或MSC-e GFP组的结肠长度都显著高于PBS组(P0.01,P0.05);病变肠组织的炎症评分MSC-IL37b组(2.9±0.2449)显著低于PBS组(5±0.4,P0.01)、MSC组(3.9±0.3317,P0.05)和MSC-e GFP组(4.2±0.3742,P0.05),MSC组显著低于PBS组(P0.05),MSC-e GFP组有低于PBS组的趋势,但无统计学差异(P=0.0639);在第10天实验结束时,MSC-IL37b组、MSC组和MSC-e GFP组无小鼠死亡,而PBS组的死亡率可达到66.7%,显著高于其它各组;脾脏CD4+T细胞中Tregs的比例MSC-IL37b组(18.95±0.9919%)显著高于MSC-e GFP组,(12.53±0.6977%,P0.001)、MSC组(13.89±0.7742%,P0.01)和PBS组(10.10±0.8365%,P0.0001),MSC组显著高于PBS组(P0.05),但MSC-e GFP组和PBS组之间的差异无统计学意义;脾脏单个核细胞中MDSCs的比例MSC-IL37b组(4.843±0.1648%)显著高于PBS组(2.693±0.4248%,P0.01)和MSC-e GFP(3.103±0.2551%,P0.05),但与MSC组(3.643±0.3143%,P=0.112)之间的差异无统计学意义;细胞内因子染色结果显示具有诱导Tregs分化功能的抑炎因子IL-2在CD4+T细胞中的表达水平明显上调,而促炎因子IFN-γ在CD4+和CD8+T细胞中的表达水平明显上调。结论IL-37b可能作为重要的抑炎因子参与了溃疡性结肠炎的疾病进展过程。IL-37b基因修饰的MSC能明显缓解DSS诱导的肠炎小鼠模型的炎症严重程度,其缓解作用优于未进行基因修饰的MSC,其机制可能是通过促进Treg和MDSC细胞分化以及下调IFN-γ的表达实现的。目的:除免疫抑制功能外,有文献报道IL-37b具有抗癌作用,但其潜在机制还不十分明确。在本研究中,我们探索了IL-37b基因转染对4T1乳腺癌生长的影响以及其机制。方法:将IL-37b腺病毒表达载体Ad-IL37b转染小鼠乳腺癌细胞系4T1(转染IL-37b基因的细胞命名为4T1-IL37b)。通过ELISA检测4T1-IL37b是否分泌性表达IL-37b蛋白。通过体外细胞增殖实验明确IL-37b基因表达是否影响4T1细胞生长。将4T1-IL37b细胞或将未转染IL-37b基因的4T1细胞与丝裂霉素处理的4T1-IL37b细胞(生长停滞,不具备成瘤性)注射至BALB/c小鼠皮下,评估肿瘤生长速度和小鼠存活率。通过CFSE实验检测IL-37b重组蛋白对T细胞体外增殖的影响。将4T1-IL37b细胞注射至BALB/c裸鼠和NOD-SCID小鼠,评估肿瘤的生长速度和小鼠的存活率。结果:病毒转染48小时后,4T1-IL37b上清中能检测到12.2±0.684 ng/ml的IL-37b蛋白。IL-37b基因的表达不影响4T1细胞的增殖速度。与不表达IL-37b基因的4T1或4T1-相比,4T1-IL37b在正常BALB/c小鼠体内的肿瘤生长速度明显更缓慢。未转染IL-37b基因的4T1细胞与丝裂霉素处理的4T1-IL37b细胞共注射组肿瘤的生长速度也明显减缓。IL-37b重组蛋白对CD4+T细胞显示直接激活作用,但对CD8+T细胞未显示激活作用。IL-37b基因转染在BALB/c裸鼠和NOD-SCID小鼠体内未显示抗肿瘤作用。结论:IL-37b基因通过作用于肿瘤微环境进而影响T细胞活化起到抗4T1乳腺癌的作用。


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