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LKB1抑制脂肪生成和分化的机制研究

韩洁  
【摘要】:近几十年来,全球肥胖人口的比例呈逐年上升趋势,肥胖逐渐成为全球范围内的流行性疾病,威胁着人类的健康。肥胖与许多疾病的发生息息相关,如2型糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病和心血管疾病等循环系统的疾病等。肥胖发生的原因除了基因突变、能量平衡失调,也包括脂肪生成和分化的异常。下丘脑作为高级中枢,参与能量和代谢平衡的调节,也可以调节脂肪的生成,在肥胖的形成过程中发挥了作用。AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate(AMP)activated protein kinase,AMPK)可以监测细胞内的能量状态,在能量不足时被活化,进而引起下游信号通路活性的改变。Leptin、insulin和ghrelin等激素可以通过调节下丘脑和外周组织内AMPK的活性,进而调节能量平衡。最近研究表明,肝激酶B1(Liver Kinase B1,LKB1)在脂肪生成和分化过程中有重要的调节作用,但具体机制不明。LKB1-STRAD-MO25异源三聚体可以通过磷酸化的方式激活AMPK,并且是其激活的必备条件。本课题组前期研究发现肥胖大鼠下丘脑和脂肪组织内LKB1表达下调,这可能与肥胖的发生相关。本研究旨在探讨中枢和外周的LKB1在脂肪生成和分化过程中的作用及相关机制。本研究分为三部分:1、高脂饲料喂养SD大鼠,建立食源性肥胖模型。16周后,高脂组(high fat diet,HF)大鼠根据体重进一步分为食源性肥胖组(diet induced obesity,DIO)和肥胖抵抗组(diet resistant,DR);普通饲料喂养的大鼠作为对照组(chow feed,CF)。建模期间监测大鼠体重和进食量。双能X线法检测大鼠体内fat mass和lean mass的质量并计算百分比。Western Blot方法检测大鼠中枢(下丘脑)和外周(脂肪组织)内LKB1和AMPK蛋白的表达,并检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的活性。Western Blot方法检测下丘脑内黑皮素受体3(melanocortin receptor 3,MC3R)蛋白的表达。初步认识中枢和外周的LKB1及下游信号与体重和脂肪含量之间的关系。2、构建过表达LKB1的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并对SD大鼠进行第三脑室内注射,在中枢内过表达LKB1。注射过表达LKB1病毒的大鼠分为高(H)、中(M)、低(L)3个剂量组,注射对照病毒的大鼠作为对照(V)组。脑室内注射后监测大鼠体重和进食量至第6周。双能X线法检测大鼠体内fat mass和lean mass的质量并计算百分比。Western Blot方法检测下丘脑内LKB1和AMPK蛋白的表达,以及MC3R、MC4R蛋白的表达。进一步探讨中枢过表达LKB1对外周脂肪生成的作用及相关机制。3、构建过表达LKB1和沉默LKB1的3T3-L1单克隆细胞系,并用胰岛素、地塞米松和1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(3-Isobutyl-1-Methylxanthine,IBMX)对细胞进行诱导分化。油红O染色方法检测细胞内脂质的含量。Western Blot方法检测前脂肪细胞因子-1(preadipocyte factor 1,Pref-1)和过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)蛋白的表达,以及LKB1和AMPK蛋白的表达及mTOR通路的活性。探讨LKB1对前脂肪细胞成脂性分化能力的作用及作用机制。本研究结论如下:1、高脂饲料导致DIO大鼠脂肪组织的质量增加,进而体重增加。DIO大鼠下丘脑和脂肪组织内LKB1/AMPK信号受损,mTOR通路异常激活,最终可导致大鼠肥胖的发生,但二者导致肥胖发生的机制不同。中枢LKB1受损可能参与了LR的形成,而外周LKB1受损则可以导致脂肪堆积。2、DR大鼠可以保持相对正常的脂肪组织的质量和含量,体重相对降低。DR大鼠可以维持脂肪组织内mTOR通路的正常活性,并激活下丘脑内AMPK和黑皮素系统,这是其维持正常的体重和脂肪含量的重要原因。3、中枢过表达LKB1后可以降低大鼠的体重,主要是由于减少躯干的脂肪含量。中枢过表达LKB1后下丘脑内AMPK和黑皮素系统的活性均显著增加。故AMPK和黑皮素系统参与介导了LKB1在中枢的作用,即中枢长期过表达LKB1可以通过激活下丘脑的AMPK和黑皮素系统最终减少外周脂肪的生成。4、在3T3-L1前脂肪细胞内过表达LKB1可以抑制成脂性分化,而沉默LKB1可以促进分化。结合前期实验结果,证实LKB1可以通过激活AMPK和抑制mTOR通路信号最终抑制前脂肪细胞的成脂性分化。


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