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需氧菌性阴道炎致病菌和TLR2/4/MyD88及介导细胞因子在其发病中作用的研究

王辰  
【摘要】:需氧菌性阴道炎(aerobic vaginitis,AV)是近年提出的一种阴道炎,致病菌、发病机制不清。我们前期研究显示,AV时阴道乳杆菌减少而革兰阳性或阴性需氧菌增多,分泌物白细胞介素(interleukin,IL)-1β/6/8升高,但何种乳杆菌减少、何种需氧菌增多,及细胞因子变化机制、与AV发生关系不明。感染相关研究发现,Toll样受体(Toll like receptors,TLR)2和4可分别识别革兰阳性菌肽聚糖和阴性菌脂多糖,激活TLR2/4信号通路、调控细胞因子产生、导致炎症,其中髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)是该信号通路中胞内关键接头分子。阴道上皮有TLR2/4表达,且AV中需氧菌增加伴细胞因子改变,这些均提示AV可能是需氧菌激活TLR2/4信号通路、上调促炎性细胞因子表达所致。高通量测序在阴道菌群分析更具优势,且液相芯片技术较酶联免疫吸附实验法更便于检测多种细胞因子浓度。因此,本研究分三部分探讨AV致病菌、TLR2/4/MyD88分子及其可能调控细胞因子的改变在AV发生中的作用。一、AV患者较健康女性阴道菌群改变分析目的:应用高通量测序了解健康女性阴道菌群构成,分析AV患者阴道菌群改变,以期发现AV致病是因某些乳杆菌菌种减少、需氧菌增加所致。方法:随机选择2014年12月~2015年12月就诊天津医科大学总医院妇科门诊AV患者53例作为实验组,选取同期天津医科大学总医院健康管理中心的健康查体女性53例作为对照组,收集阴道灌洗液离心沉淀样本提取总DNA,针对细菌16S rRNA V4区PCR扩增产物测序,通过比较两组在不同分类层级下物种差异,探讨AV患者较健康女性阴道菌群改变。结果:(1)AV组与对照组测序有效序列量分别为3195798个、3264786个;共聚类2459个“操作分类单元”(Operational Taxonomic Units,OTU),AV组(70[39~1514]个)平均OTU数显著高于对照组(53[37~506]个,P0.001);两组在不同分类层级下物种注释共发现25个门、51个纲、110个目、224个科、483个属及719个种。其中,AV组、对照组分别注释有626、516个菌种。(2)AV组阴道菌群与对照组相比有显著差异(R=0.4571;A=0.1737;P=0.001)。厚壁菌门(乳杆菌属所在分类上级)在对照组占绝对优势(97.90%),在AV组平均相对丰度显著下降(58.19%,P0.001);而放线菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭菌门等在AV组较对照组显著增加(P0.001)。(3)健康女性阴道内发现18个乳杆菌菌种。其阴道菌群中,卷曲乳杆菌(64.76%)和惰性乳杆菌(29.79%)构成94.55%细菌量,其他平均相对丰度0.1%的13个菌种依次为阴道加德纳菌(1.01%)、德氏乳杆菌(0.99%)、加氏乳杆菌(0.62%)、咽颊炎链球菌(0.38%)、尿道气球菌(0.28%)、无乳链球菌(0.23%)、中间普雷沃菌(0.22%)、阴道阿托波氏菌(0.16%)、纤毛菌(0.16%)、阴道乳杆菌(0.14%)和非解乳糖链球菌(0.13%)。(4)av组发现与对照组相同的18个乳杆菌菌种,但卷曲乳杆菌显著减少(10.54%,p0.001),惰性乳杆菌丰度与对照组无差别(p=0.191),惰性乳杆菌丰度(30.39%)约为卷曲乳杆菌(10.54%)3倍。患者阴道内多种需氧菌及兼性厌氧菌显著增加,如咽颊炎链球菌、无乳链球菌、尿道气球菌、非解乳糖链球菌、肺炎克雷伯菌、缓症链球菌、粪肠球菌、孪生菌、表皮葡萄球菌、阴道加德纳菌等(p0.05),同时还发现部分专性厌氧菌丰度也较对照组升高,如阴道阿托波氏菌、中间普雷沃菌、普氏厌氧球菌等(p0.05)。(5)av组检测到生殖支原体、人型支原体和解脲脲原体阳性者比例分别为32.08%(17/53)、52.83%(28/53)、84.91%(45/53);对照组阳性者比例分别为3.77%(2/53)、18.87%(10/53)、62.26%(33/53)。两组相比av患者这三种支原体的携带率都更高(χ28.116,p=0.017),但两组支原体在阴道菌群中平均相对丰度均较低(0.1%)。结论:(1)健康女性阴道菌群分布相对集中化、个体差异小,主要以卷曲乳杆菌和惰性乳杆菌为优势菌,此外正常阴道菌群中常见细菌还包括阴道加德纳菌、德氏乳杆菌、加氏乳杆菌、咽颊炎链球菌、尿道气球菌、无乳链球菌、中间普雷沃菌、阴道阿托波氏菌、纤毛菌、阴道乳杆菌和非解乳糖链球菌等。(2)av患者阴道内卷曲乳杆菌显著减少,菌群构成个体差异大、菌群多样性增加,咽颊炎链球菌、无乳链球菌、尿道气球菌、非解乳糖链球菌、肺炎克雷伯菌、缓症链球菌、粪肠球菌、孪生菌、表皮葡萄球菌、阴道加德纳菌等多种需氧菌及兼性厌氧菌丰度增加,提示av致病与多种菌混合感染有关而非单一致病菌。av患者支原体携带率较健康女性高,提示支原体可能参与av发病。二、tlr2、tlr4、myd88在av发病中的表达及意义目的:研究阴道黏膜固有免疫识别系统tlr2/4信号通路中关键分子tlr2/4、myd88mrna在av的表达情况。方法:选择2015年8月~2016年1月就诊av患者29例作为实验组,选取同期健康查体女性30例作为对照组,收集阴道侧壁上1/3上皮细胞标本,采用real time RT-PCR方法检测TLR2/4、MyD88 mRNA在AV组和对照组间表达差别,分析MyD88与TLR2/4 mRNA表达相关性,比较TLR2/4、MyD88 mRNA在轻、中和重度AV组间表达差异。探讨TLR2/4、MyD88分子在AV发生中的作用。结果:(1)AV组阴道上皮细胞标本TLR2、TLR4、MyD88 mRNA表达量均高于对照组(P0.001)。(2)MyD88与TLR2、TLR4 mRNA表达呈正相关(P0.05)。(3)重度AV组TLR2、TLR4、MyD88 mRNA均比轻度AV组表达量高(P0.05),重度AV组MyD88 mRNA比中度AV组表达量高(P0.05)。结论:需氧菌可能激活TLR2/4信号通路参与AV发生及疾病严重程度的加重。三、AV患者阴道环境细胞因子浓度分析目的:研究AV患者阴道环境细胞因子分泌情况,分析TLR2/4/MyD88分子表达与细胞因子产生水平相关性,探讨其在AV发生中的作用。方法:选择2015年9月~2015年12月就诊AV患者19例作为实验组,选取同期健康查体女性20例作为对照组,收集阴道灌洗液分离上清,采用液相芯片测定12种细胞因子(促炎因子:IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12p70、IL-17、IFN-γ、TNF-α;抑炎因子:IL-4、IL-10、IL-13)浓度,分析AV组较对照组浓度显著升高的细胞因子,比较AV组内不同严重程度组间细胞因子浓度差异,结合第二部分研究,分析TLR2/4/MyD88 mRNA表达与细胞因子浓度相关性。结果:(1)AV组较对照组IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12p70、IL-17、TNF-α浓度显著升高(P0.05)。(2)重度AV组IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α浓度较轻度AV组显著升高(P0.05)。(3)TLR2、TLR4、MyD88 mRNA相对表达量与阴道微环境中IL-1β、IL-6、IL-12p70、IL-17浓度呈正相关(P0.05)。结论:AV表现为阴道局部免疫失衡状态,更多促炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12p70、IL-17和TNF-α通过表达上调参与阴道炎症反应,且重度AV时促炎性细胞因子水平显著提高,表现出更为明显的阴道局部免疫失衡,从细胞因子水平解释了疾病严重程度个体差异的病理机制。TLR2/4/MyD88信号转导通路及其诱导上调的促炎性细胞因子在AV发病中起重要作用。


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