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血糖波动所致氧化应激对ARPE-19细胞自噬功能的影响及其机制研究

宋建  
【摘要】:目的:观察在血糖波动的培养条件下,人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞内氧化应激及自噬水平的变化,研究氧化应激与自噬之间的相互关系,并进一步阐明其具体的作用途径,为通过调控自噬治疗糖尿病视网膜病变(DR),提供理论基础。方法:1.根据血糖浓度将细胞分别培养于正常(C)组、高糖(HG)组、波动(IHG)组及高渗(H)组,分别培养48h。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,观察不同血糖浓度对细胞活力的影响。采用多种不同氧化应激试剂盒(活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)),检测上述各组细胞内的氧化应激水平。2.血糖波动条件下,通过透射电镜(TEM)观察细胞内自噬体的形成情况。蛋白质免疫印迹(western blot,WB)法检测细胞内自噬水平的变化及应用自噬阻断剂:氯化铵(NH4Cl)前后,细胞内自噬通量的变化。WB法检测应用抗氧化剂:N-乙酰半胱氨酸(NAC)前后,细胞内自噬水平变化,研究氧化应激与自噬间的关系。3.血糖波动条件下,细胞免疫荧光法观察高迁移族蛋白1(HMGB1)在细胞内的分布情况。WB法检测应用HMGB1阻断剂:丙酮酸乙酯(EP)前后,细胞内自噬水平变化及ROS试剂盒检测细胞内ROS水平变化。结果:1.细胞形态:C组细胞细胞排列规律,表现为长梭形、三角形及少量不规则形,胞质内可见少量灰黑色颗粒;H组与C组相比并无明显差异,而HG组及IHG组,细胞胞体变薄又瘦,形态多样,不规则细胞明显增多,且IHG组细胞变化更为明显。2.细胞活力:异常高糖条件下的细胞活力呈现不同程度的下降,IHG组最明显,且差异有统计学意义(p0.05),而H组与C组相比无明显差异(p0.05)。3.氧化应激:与C组相比,细胞的氧化应激水平,在H组及IHG组明显升高,表现为两组ROS、MDA水平明显升高,SOD水平降低,且差异有统计学意义(p0.05),而H组差异均无统计学意义(p0.05)。IHG组与HG组相比,ROS、MDA水平明显升高,差异有统计学意义(p0.05),而SOD差异不明显,无统计学意义(p0.05)。4.自噬:TEM:IHG组细胞内自噬体明显多于C组。蛋白表达:与C组相比,自噬相关蛋白LC3表达明显升高,而p62蛋白表达降低,差异有统计学意义(p0.05)。NH4Cl预处理后,LC3表达降低,而p62表达升高,且差异有统计学意义(p0.05)。NAC预处理后,LC3表达降低,而p62表达升高,且差异有统计学意义(p0.05)。5.免疫荧光:细胞内HMGB1从细胞核释放到胞浆,IHG组明显多于C组,荧光显微镜下,胞浆内可见点状绿色强荧光。EP预处理后,细胞LC3蛋白表达水平明显降低,而p62表达升高,且差异有统计学意义(p0.05)。同时,细胞内ROS水平升高,且差异有统计学意义(p0.05)。结论:1.异常的高糖环境能够造成ARPE-19细胞的损伤,尤其是血糖波动造成的损伤更为明显。2.血糖波动条件下,ARPE-19细胞的氧化损伤水平明显升高,氧化损伤能够诱导细胞自噬的发生。3.血糖波动条件下,ARPE-19细胞通过HMGB1途径启动自噬,自噬启动后能够降低细胞内的氧化损伤水平,故对细胞起到保护作用


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