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多功能纳米胶束体系联合声动力与化疗靶向治疗肝癌的研究

刘洋  
【摘要】:研究背景和目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内威胁人类生命的最为严重的疾病之一。传统化疗药物缺乏肿瘤选择性、毒副作用大、容易产生多药耐药效应。至今,传统方法对HCC的治疗未取得实质性进展。声动力疗法是一种新兴的肿瘤治疗方案。声敏药物在肿瘤部位富集后,施加匹配吸收波长的超声波照射,能生成活性很强的单线态氧,产生细胞毒性作用。声动力疗法在肿瘤治疗方面显示出巨大的潜力。本文设计并构建了一个结构简单的、具有生物相容性的多功能纳米载药系统HPDF,HPDF的结构是卟啉类化合物血卟啉(HP)与蒽环类化疗药物阿霉素(DOX)通过π-π共轭作用形成的纳米复合物,然后以两亲性嵌段共聚物Pluronic F68通过疏水作用包裹纳米复合物形成亲水外壳而构成。本课题研究了F68对声敏剂HP与化疗药物DOX的高效共载、肿瘤靶向递送及其联合声动力与化疗治疗肝癌的效果和相关机制。研究方法:1.合成HP与DOX的纳米复合物HPD,用Pluronic包裹形成纳米药物HPDF。通过透射电子显微镜、原子力显微镜及动态光散射研究其形貌、粒径以及电位和体外稳定性。高效液相色谱分析对药物的体外释放行为进行检测。2.运用CCK-8法检测不同处理组细胞中药物半数抑制浓度和增殖情况的变化。流式细胞术定量检测不同处理组细胞的药物摄取量。活细胞成像和激光共聚焦观察药物在肝癌细胞中的药物分布,转移和亚细胞定位。荧光定量PCR技术检测Nanog~(Neg)细胞和Nanog~(Pos)肝癌细胞中相关干性基因的表达。3.流式细胞术检测不同处理组Hep G2细胞凋亡与周期变化以及细胞内活性氧的生成。激光共聚焦检测线粒体膜电位的变化和细胞色素C的亚细胞定位,Western blot检测线粒体凋亡以及核损伤相关蛋白的表达变化。4.建立肝癌裸鼠皮下模型,使用Cy5.5荧光标记纳米复合药物HPDF,小动物活体成像考察其肿瘤靶向性以及在裸鼠体内的组织分布情况;冰冻切片观察HPDF纳米胶束中的DOX在心脏和肿瘤的累积。5.尾静脉注射不同药物对荷瘤小鼠进行治疗,绘制肿瘤生长曲线。HE染色检测HPDF的生物安全性及其对肿瘤组织的杀伤作用;Masson三色染色法检测不同处理组中肿瘤内胶原沉积的情况。CD31免疫组化染色检测不同处理组肿瘤内血管的生长情况。研究结果:1.Pluronic F68包裹HPD形成的HPDF纳米胶束平均直径为87.9±10.8 nm,具有典型的核壳结构和较好的体外稳定性。在酸性环境下,HPDF实现了药物p H敏感性释放。2.与游离DOX相比,联合超声波照射时HPDF纳米胶束能够显著增加Hep G2细胞内ROS水平并在超声处理12 h后达到最高值。游离DOX和HPDF纳米胶束均能造成线粒体膜损伤和Cyt c的释放。HPDF纳米胶束联合超声照射处理展现出活化caspase-9、caspase-3、p53和Rad51的最高表达水平。3.HPDF纳米粒子容易被Hep G2细胞摄取,通过逃逸溶酶体转移到细胞核。与游离DOX相比,HPDF纳米胶束联合超声照射的IC_(50)降低约5.5倍。流式结果表明,HPDF结合超声波照射后可诱导细胞凋亡和细胞周期S期的阻滞。4.与Nanog~(Neg)细胞相比,Nanog~(Pos) CSCs干性相关基因Nanog,Oct4和Sox2的表达水平均显著增高。与游离DOX相比,HPDF纳米胶束联合超声照射的IC_(50)降低约10倍。HPDF纳米胶束可以有效地将DOX递送到具有耐药性的Nanog~(Pos) CSCs中并提高DOX在细胞核中的积累。5.尾静脉注射4 h后,HPDF/Cy5.5纳米胶束开始在Hep G2荷瘤小鼠肿瘤中蓄积,在6-8 h内达到最高水平,24 h后几乎只能在肿瘤中观察到。与游离DOX相比,由HPDF纳米胶束递送的DOX在荷瘤小鼠心脏中的分布显著减少,在肿瘤中的蓄积量显著增加。6.结合超声波照射后,HPDF纳米胶束几乎能够完全抑制肿瘤生长,同时Hep G2荷瘤小鼠主要器官中没有观察到可检测的病理变化或损伤。经过HPDF纳米胶束和超声辐射联合治疗的小鼠显示出最低的肿瘤微血管密度和对肿瘤内胶原沉积的最强的抑制作用。结论:本文设计并构建了一种结构简单、具有良好生物相容性的多功能纳米载药系统HPDF,其可以实现HCC声动力和化疗的协同治疗,在临床肿瘤治疗应用上展示出巨大的潜力。


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