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免疫性血小板减少症患者NK细胞数量及功能研究

张玉娇  
【摘要】:原发免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是以血小板减少为特征的自身免疫性疾病,在出血性疾病中约占1/3。主要病因为骨髓巨核细胞异常使血小板生成减少或者患者体内产生专门针对血小板的自身抗体破坏血小板过多所致。近些年,作为一种免疫调节细胞,NK细胞在自身免疫性疾病中的研究越来越多。有研究发现[1]系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中NK细胞数量减少、杀伤活性降低,且合并血小板减少和关节炎的患者NK细胞数量的减少更加显著,认为NK细胞在本病发生中主要起保护性作用。此外RA[2]、Graves病[3]中也有同样的发现。在ITP中NK细胞相关的研究尚少,而且研究多数集中于用流式细胞术方法检测NK细胞的数量变化,本研究通过不同的检测方式检测不同疾病状态ITP患者及健康对照者外周血中NK细胞数量、亚群、杀伤功能及其分泌细胞因子的变化,进一步探讨在ITP发病机制中NK细胞的作用。第一部分免疫性血小板减少症患者NK细胞数量、亚群及杀伤功能的研究目的:探讨免疫性血小板减少症(ITP)患者外周血NK细胞数量、亚群和杀伤功能的研究。方法:选取2015年9月至2016年4月天津医科大学总医院血液科住院的初诊免疫性血小板减少症(ITP)患者34例,完全缓解ITP患者32例及健康志愿者30名。采用流式细胞术检测外周血NK细胞及其亚群比例,激活性受体NKp44及抑制性受体NKG2A,胞质蛋白穿孔素及颗粒酶β的表达水平,并将其与ITP患者的免疫状态及血小板计数水平做相关性分析。结果:(1)NK细胞及其亚群占外周血淋巴细胞比例:NK细胞:初诊组(10.99±4.89)%及完全缓解组(9.73±6.75)%显著低于对照组(14.67±7.24)%(P=0.023、0.003),初诊患者中治疗有效组(11.71±5.5)%显著高于难治组(7.97±3.07)%(P=0.045);Bright亚群:初诊组(0.48±0.23)%及完全缓解组(0.41±0.33)%显著低于对照组(0.64±0.32)%(P=0.037、0.002);Dim亚群:初诊组(10.16±5.02)%及完全缓解组(8.07±5.74)%显著低于对照组(14.16±7.19)%(P=0.009、0.007);(2)各亚群占NK细胞的比例:Bright亚群:初诊组(6.48±4.33)%显著高于对照组(4.21±2.70)%(P=0.020),Dim亚群:初诊组(93.51±4.33)%显著低于对照组(95.79±2.70)(P=0.020)(3)激活性受体NKp44:初诊组0.28(0.95)%显著低于完全缓解组0.61(2.05)%及对照组0.92(0.90)%(P=0.047、0.048);抑制性受体NKG2A:初诊组(42.34±23.86)%显著高于对照组(29.25±12.83)%(P=0.009),CD16:初诊组(93.51±4.33)%显著低于对照组(95.79±2.70)%(P=0.020);(4)穿孔素:初诊组87.52(25.29)%显著低于对照组91.55(8.29)%(P=0.025),颗粒酶β三组之间差异无统计学意义(P值分别为0.560,0.426,0.179)。(5)NK细胞与外周血杀伤T细胞(CD3+CD8+)呈负相关(n=41,r=-0.387,P=0.012),与B1细胞(CD5+CD19+)呈负相关(n=66,r=-0.273,P=0.028),与外周血辅助杀伤细胞比值(CD3+CD4+/CD3+CD8+)呈正相关(n=41,r=0.358,P=0.028),与外周血血小板计数呈正相关(n=66,r=0.314,P=0.011)。结论:ITP患者可能因其外周血NK细胞数量减少,发育障碍、功能降低,对自身反应性T、B细胞的抑制不足导致疾病的发生。第二部分原发免疫性血小板减少症患者NK细胞相关免疫负调控的研究目的:探讨原发免疫性血小板减少症(ITP)患者外周血中NK细胞及其相关细胞因子IFN-γ、IL-10、TGF-β的变化。方法:以22例初诊ITP患者(初诊组)、20例治疗后完全缓解ITP患者(完全缓解组)为研究对象,20名健康志愿者为对照组。采用ELISA法检测三组受试者血清IFN-γ及IL-10的水平;流式细胞术检测NK细胞(CD3-CD56+)及其Bright亚群(CD3-CD56bright CD16-)、Dim亚群(CD3-CD56dim CD16+)的水平;采用免疫磁珠法分离NK细胞,实时荧光定量PCR检测IFN-γ、IL-10、TGF-β基因m RNA的表达,并将以上测得结果做相关性分析。结果:(1)初诊组ITP患者血清IFN-γ浓度[(653.0±221.6)ng/L]高于完全缓解组[(484.4±219.5)ng/L]和对照组[(390.9±253.5)ng/L](P值分别为0.022、0.001),血清IL-10浓度低于对照组[(52.09±26.66)ng/L对(79.44±38.43)ng/L,P=0.007]。(2)初诊组、完全缓解组患者外周血NK细胞比例[(9.53±3.93)%、(9.03±3.78)%]均显著低于对照组[(13.72±7.42)%](P值分别为0.013、0.007),初诊患者外周血Bright亚群占NK细胞的比例高于对照组[(6.85±4.43)%对(4.05±2.81)%,P=0.032],而初诊组外周血Dim亚群占NK细胞的比例低于对照组[(93.14±4.43)%对(95.94±2.81)%,P=0.032]。(3)初诊组、完全缓解组及对照组NK细胞IFN-γ基因m RNA表达差异无统计学意义(P0.05),初诊组NK细胞IL-10、TGF-β基因m RNA表达高于对照组(1.82±1.32对1.02±1.03,P=0.023;2.80±2.31对1.46±1.37,P=0.028)。外周血Bright细胞占NK细胞的比例与NK细胞IL-10及TGF-β基因m RNA表达成正相关(r分别为0.424、0.432,P值均0.05)。结论:NK细胞可能通过加强分泌免疫负调控因子来代偿其数量的不足,在疾病中起保护作用。


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