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中药治疗转移性乳腺癌网络药理学机制预测

毛宇  
【摘要】:目的:乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一,在女性恶性肿瘤中,其发病率仅居于肺癌之下。中药在治疗恶性肿瘤中发挥着重要的作用。但中药具有多成分、多靶点的特点,其抗乳腺癌的机制非常复杂,抗肿瘤机制有待阐明。在这项研究中,我们选取了Ⅳ期转移性乳腺癌患者作为研究对象,根据是否使用中药治疗将其分成中药组和对照组,通过随访和统计比较两组的生存差异。进一步的研究中,我们针对中药多成分、多靶点的特点,采用网络药理学的方法,对中药治疗乳腺癌的有效成分进行分析,根据其分子结构特征进行靶点预测,总结其主要作用的机制。通过网络药理学的分析方法,为每一种中药发挥抗乳腺癌作用提供依据,并以此指导临床用药。随后,根据网络药理学分析的结果,我们选择与生存期相关性较强的一味中药——瓜蒌进行实验方法的验证,证实了其通过预测的机制发挥抗乳腺癌的治疗作用。方法:1、病例收集:本研究收集了于2004年6月-2011年12月收入天津医科大学附属肿瘤医院的182例Ⅳ期转移性乳腺癌病例进行回顾性分析。通过分析182例乳腺癌患者的住院和门诊资料,将病人分为中药组和对照组。2、生存分析:采用Kaplan-Meier法和COX比例风险模型对两组病人的生存情况进行分析统计,比较两组的中位生存期和1、3、5年生存率是否存在统计学差异,判断中药治疗是否为独立的保护性预后因素。3、网络药理学分析:统计中药组病人中药处方,计算各位中药使用频次,使用双变量相关分析方法筛选出与生存期相关的中药。在网络数据库TCMSP、TCMID上查找所筛中草药的所有有效成分和作用靶点并归类总结。通过互联网TTD数据库及相关文献搜寻与乳腺癌发病及治疗有关的靶点。将所查乳腺癌的治疗靶点和中药有效成分的作用靶点进行分子对接,使用Cytoscape软件形成成分靶点网络图。按照不同经典信号通路的分类方法,将对接的靶点进行归类和总结。4、根据预测结果,选用中药瓜蒌作为研究对象,培养SKBR-3乳腺癌细胞,加入不同浓度的瓜蒌水提物,48小时后,使用CCK-8实验的方法观察水提物对乳腺癌细胞增殖的影响。5、选用葫芦素B(CuB)作为研究对象,培养SKBR-3乳腺癌细胞,加入不同浓度的CuB,24小时后观察各组细胞形态及数量变化。并分别在不同的时间点使用台盼蓝据染实验和CCK-8实验观察CuB对乳腺癌细胞增殖的影响。6、选取乳腺癌SKBR-3细胞,实验分组同上,采用划痕实验和Transwell实验观察CuB对SKBR-3细胞迁移的影响。7、选取乳腺癌SKBR-3细胞,实验分组同上,通过流式细胞仪检测CuB对SKBR-3细胞凋亡的诱导作用。8、选取乳腺癌SKBR-3细胞,实验分组同上,通过流式细胞仪检测CuB对SKBR-3细胞周期分布的影响。9、通过Western-blot检测经CuB处理过的SKBR-3细胞与增殖和凋亡相关的蛋白表达情况。结果:1、生存分析结果:(1)本研究收集了于2004年6月-2011年12月收入天津医科大学附属肿瘤医院的182例Ⅳ期转移性乳腺癌病例。其中中药组病例78例,对照组病例104例。(2)生存分析结果显示,中药组病人中位生存期为55个月,对照组中位生存期为23个月。两组1、3、5年生存率分别为96.0%,69.0%,44.0%和72.1%,36.5%,24.7%(P0.001)。(3)Cox比例风险回归模型表明,中药治疗是一个独立的保护性预后因素(HR=0.591,95%CI:0.395-0.885,P0.05)。2、网络药理学分析结果:(1)双变量相关分析结果显示10味中药与生存期成强相关,按照相关系数由强到弱分别是:醋青皮、醋商陆、鹿角霜、橘叶、瓜蒌、姜炭、浙贝母、淫羊藿、三七、甘草。(2)通过搜寻TCMSP、TCMID数据库,找到在上述10味中药中的共1192个有效成分,靶点2736个。通过查找相关文献和网络TTD数据库,确立了120个与乳腺癌相关的治疗靶点。通过分子对接最终确立于10味有效中药的所有成分中,总共与乳腺癌相关的成分254个,靶点81个。(3)经过总结分析,10味中药主要是通过作用于ER、HSP90、TOP-II相关信号通路分子靶点发挥抗乳腺癌作用。其中瓜蒌主要是作用于凋亡信号通路相关分子。3、实验验证结果:(1)瓜蒌粗提物(TKE)对SKBR-3细胞增殖的影响:不同浓度的TKE(2.5、5、10、20μg/mL)作用于SKBR-3细胞48小时以后,CCK-8实验显示,在TKE浓度为20μg/m L时,乳腺癌细胞增殖受到了明显的抑制作用(P0.0001)。(2)葫芦素B(CuB)对SKBR-3细胞增殖的影响:设置低中高不同浓度的CuB实验组(30、60、120 nM),分别于24、48、72、96小时加入CCK-8试剂并测定OD值,制作生长曲线。结果显示低中高CuB组的吸光度均明显下降,且成时间和剂量依赖性(P0.0001)。台盼蓝拒染实验显示三组的细胞数目明显下降,且成剂量依赖性(P0.0001)。(3)葫芦素B(CuB)对SKBR-3细胞凋亡和周期分布的影响:设置不同浓度的CuB(30、60、120、240 nM),12h后通过流式细胞术发现,凋亡的SKBR-3细胞数目明显增加。其中240nM组凋亡率最高59.63(±0.85)%。从细胞周期检测的结果中可以看出,CuB使细胞阻滞于G2/M期。(4)葫芦素B(Cu B)对SKBR-3细胞迁移的影响:划痕实验:设置CuB低中高剂量组(30、60、120 nM),每组分别在加入药物和加药后10小时测定SKBR-3细胞迁移的距离。从图片上可以看出CuB对乳腺癌细胞迁移具有一定的抑制作用。三个剂量组的迁移距离明显减小(P0.0001)Transwell实验:设置CuB低中高剂量组(30、60、120 nM),每组在加药后12小时测定Transwell小室底面的SKBR-3细胞数目。由图片看出,实验组迁移的细胞数目明显减少,且呈剂量依赖性(P0.0001)。(5)CuB抗乳腺癌的机制验证:经Western-blot实验发现,加入药物后,SKBR-3细胞增殖和凋亡信号通路的蛋白表达发生了变化。在CuB高剂量组(120nM),与细胞增殖有关的AKT、Ras蛋白表达减少;抑制细胞凋亡的蛋白Bcl-2表达下降,促调亡蛋白Caspase-9表达升高。结论:1、临床研究显示,中药治疗能够提高晚期转移性乳腺癌患者的生存期,差别存在统计学和临床意义。2、网络药理学分析表明,与生存期改善明显相关的中药主要是通过作用于ER、HSP90、TOP-II相关信号通路分子靶点发挥抗乳腺癌作用的。3、实验验证结果表明,葫芦素B能够通过抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制迁移的机制发挥抗乳腺癌的作用,能够部分吻合网络药理学预测的结果,提示网络药理学可以为探索药物作用机制提供新的思路和方法。


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