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肝硬化及肝硬化合并糖尿病患者肠道微生态研究

刘保文  
【摘要】:目的本课题利用高通量测序技术全面分析肝硬化以及肝硬化合并糖尿病患者肠道菌群变化,比较二者之间的菌群差异,在此基础之上进一步探讨肝硬化合并糖尿病患者血糖水平与肠道菌群之间的关联性以及肝硬化患者Child-Pugh评分相关的肠道菌群。方法选取2015年11月至2016年4月期间天津市第三中心医院消化科住院病人35人,共分为两组,其中一组为肝硬化病人20人,另一组为肝硬化合并糖尿病病人15人,对两组患者进行新鲜粪便标本采集,并迅速置于-80℃冰箱冷冻保存,利用粪便DNA提取试剂盒提取35例患者粪便DNA,对提取后的DNA进行纯化,然后进行琼脂凝胶电泳检测。对检测合格的DNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行质量检测和纯化,利用Roche454高通量测序平台对两组患者的粪便菌群16SrDNA的V3-V6区域进行测序,根据测序结果总体分析比较肝硬化组和肝硬化合并糖尿病组两组患者肠道菌群之间的相似性及差异性;将两组患者分别根据病因分类,比较不同病因下肠道菌群的差异;比较相同病因下两组肠道菌群的差异性;分析与肝硬化合并糖尿病患者空腹血糖具有相关性的肠道菌群以及与肝硬化患者Child-Pugh评分相关的肠道菌群。结果1.本课题所选取的20例肝硬化患者及15例肝硬化合并糖尿病患者在年龄、性别以及Child-Pugh评分之间无显著统计学差异,其中空腹血糖指标,肝硬化合并糖尿病组明显高于肝硬化组(P=0.004)。2.35例样本共获得有效序列361887条,肝硬化组获得有效序列总数是162499条,平均每个样本有8125条序列;15例肝硬化合并糖尿病组有效序列总数是199388条,每个样本平均有13293条序列。利用Uclust程序将相似度为97%的聚类为一个OTU,两组共获得13812个OTU,肝硬化组共7159个OTU,每个样本平均333个,肝硬化合并糖尿病组共6653个OTU,每个样本平均477个,且两组OTU个数无差异。3.样本多样性分析显示,肝硬化和肝硬化合并糖尿病两组的chao1指数、Simpson指数以及shannon指数均无显著差异;样本内复杂度分析显示,各样本的稀疏曲线随着测序量的增加逐渐趋于平缓。样本主成分分析显示,35个样本无法通过PC1-PC2-PC3坐标系完全区分开来,说明两组样本在聚类上没有明显差别,肠道菌群结构具有较大的相似性。4.从样本群落结构分析结果来看,肝硬化和肝硬化合并糖尿病两组样品在门、纲、目、科、属五大分类水平中所含物种种类相似,但各水平物种分布仍存在明显差异。在门的水平上,肝硬化合并糖尿病患者肠道菌群中的变形菌门比例显著增加(8.8%vs2.4%,P=0.001),同时拟杆菌门与厚壁菌门的比值也稍大于肝硬化组的比值(3.3VS2.1,P=0.063);在纲的水平上,肝硬化合并糖尿病组患者肠道菌群中的γ-变形菌纲和β-变形菌纲所占比例均明显大于肝硬化组(5.5%vs1.6%,P=0.001;1.5%vs0.5%,P0.001);在目的水平上,相比肝硬化合并糖尿病组,肝硬化组患者肠道菌群中的丹毒丝菌目和脱硫弧菌目占明显优势(0.6%vs0.2%,P=0.016;0.2%vs0.1%,P=0.01),而肝硬化合并糖尿病患者肠道菌群中的伯克氏菌目和肠杆菌目比例显著增加(1.5%vs0.6%,P0.001;6.5%vs2.6%,P=0.001),肝硬化合并糖尿组的巴斯德氏菌目所占比例稍多于肝硬化组(0.6%vs0.3%,P=0.075);在科的水平上,紫单胞菌科、肠杆菌科、韦荣球菌科、产碱菌科均在肝硬化合并糖尿病组占明显优势(4.1%vs2.2%,P=0.005;6.5%vs1.3%,P=0.001;3.8%vs2.6%,P=0.019;1.5%vs0.6%,P0.001),肝硬化患者肠道菌群中的梭菌科、毛螺旋菌科、丹毒丝菌科、脱硫弧菌科所占比例显著增加(0.3%vs0.2%,P=0.028;14.8%vs9.9%,P=0.016;0.5%vs0.2%,P=0.016;0.2%vs0.1%,P=0.016),肝硬化合并糖尿病组的拟杆菌科比例稍多于肝硬化组(51.6%vs41.9%,P=0.07);在属水平中,肝硬化患者肠道菌群中相对富集的是Butyricimonas、Blautia、粪球菌属、Dorea、Faecalibacterium、双歧杆菌属六种菌属(0.3%vs0.1%,P=0.011;0.5%vs0.2%,P=0.017;0.6%vs0.2%,P=0.012;0.4%vs0.2%,P=0.022;6.4%vs2.2%,P=0.001;0.7%vs0%,P=0.001,);而parabacteroides、萨特氏菌属、Roseburia、克雷伯氏菌属在肝硬化合并糖尿病病人肠道菌群中所占比例较大(4.3%vs2.2%,P=0.002;1.5%vs0.5%,P0.001;1.6%vs0.1%,P0.001;0.7%vs0%,P0.001),毛螺菌属肝硬化组稍多于肝硬化合并糖尿病组(3.3%vs1.6%,P=0.069)。5.通过Kruskal-Wallis H检验我们发现在本课题中在肝硬化组和肝硬化合并糖尿病组两组中不同病因患者间肠道菌群在门、纲、目、科、属五大水平中均无明显差异。6.对具有相同病因的肝硬化和肝硬化合并糖尿病两组患者肠道菌群进行一一比较,经比较发现在乙肝病因组中,变形菌门、β-变形菌纲、伯克氏菌目、韦荣球菌科、产碱菌科、Parabacteroides、Roseburia、韦永氏球菌属、萨特氏菌属在乙肝肝硬化患者肠道中要明显少于在乙肝肝硬化合并糖尿病患者的肠道菌群的比例(2.8%vs7.7%,P=0.007;0.5%vs2.2%,P=0.001;0.5%vs2.2%,P=0.001;2.7%vs6.8%,P=0.003;0.5%vs2.2%,P=0.001;2.7%vs5.2%,P=0.036;0.1%vs1.5%,P0.001;0.2%vs2.8%,P=0.011;0.5%vs2.2%,P=0.001),而链球菌科、梭菌科、Faecalibacterium、链球菌属在乙肝肝硬化患者肠道中占优势(0.7%vs0.1%,P=0.021;0.4%vs0.2%,P=0.027;8.1%vs2.6%,P=0.044;0.7%vs0.1%,P=0.02);在自身免疫性病因中,自身免疫性肝硬化合并糖尿病患者肠道中的拟杆菌门、变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、链球菌科、肠杆菌科、Roseburia、韦荣氏球菌属、链球菌属多于自身免疫性肝硬化患者(80.2%vs52.3%,P=0.044;8.6%vs2.5%,P=0.002;8.0%vs1.8%,P0.001;7.9%vs1.4%,P0.001;0.9%vs0.2%,P=0.015;7.9%vs1.4%,P0.001;1.0%vs0.2%,P=0.015;1.2%vs0.9%,P=0.012;0.9%vs0.2%,P=0.015),而自身免疫性肝硬化患者肠道的粪球菌属较多(0.5%vs0.1%,P=0.001);丹毒丝菌目、毛螺旋菌科、Butyricimonas、Dorea的在不明原因性肝硬化患者肠道中所占的比例高于相同病因下合并糖尿病的患者(0.3%vs0.2%,P=0.026;15.7%10.8%,P=0.024;0.8%vs0.1%,P=0.004;0.2%vs0.1%,P=0.001);其余病因的比较两组间未发现明显差异。7.在肝硬化合并糖尿病患者肠道菌群中,γ-变形菌纲与空腹血糖呈正相关,肠杆菌科、韦荣球菌科、克雷伯氏菌属与空腹血糖近似正相关。8.在肝硬化合并糖尿病患者肠道菌群中,未发现与Child-Pugh评分相关的肠道菌群。9.在肝硬化患者肠道菌群中,Roseburia、Parabacteroides和紫单胞菌科的比例水平均与肝硬化患者Child-Pugh评分呈负相关,韦荣氏球菌属与Child-Pugh评分呈正相关。结论肝硬化与肝硬化合并糖尿病患者的肠道菌群结构具有相似性但又存在各自的特异性,肠道菌群中存在某些与肝硬化合并糖尿病患者血糖水平相关的细菌以及与肝硬化患者病情相关的细菌,为临床通过调节菌群结构治疗肝硬化和肝硬化合并糖尿病提供理论依据。


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