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miR-139-5p过表达对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

陈伟佳  
【摘要】:目的:检测mi R-139-5p过表达对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的影响及其下游靶基因,初步探讨其作用机制。方法:1.构建miR-139过表达重组慢病毒载体并建立其稳定转染H9c2心肌细胞系构建并包装miR-139过表达慢病毒载体,测定其滴度,将其转染进H9c2细胞,检测转染效率。提取细胞总RNA,实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)方法检测转染细胞中miR-139-5p的表达,结合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达情况鉴定mi R-139-5p稳定转染细胞系是否构建成功。2.miR-139-5p过表达对H9c2心肌细胞H/R损伤的影响实验分组:miR-139-5p过表达阴性对照组(NC),miR-139-5p过表达阴性对照缺氧/复氧组(NC+H/R)和miR-139-5p过表达缺氧/复氧组(miR-139-5p+H/R)。NC组细胞加入对照液培养6 h,NC+H/R组和miR-139-5p+H/R组细胞加入缺氧液经历缺氧4 h/复氧2 h培养。MTT法检测细胞存活率,比色法检测细胞培养液内乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡情况。3.miR-139-5p在H9c2心肌细胞中靶基因的预测和验证利用生物信息学工具,结合相关文献,选取胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)和胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)为miR-139-5p的预测靶基因。运用双荧光素报告基因实验在293T细胞中检测miR-139-5p是否能与IRS1的3'非翻译区(3′-untranslated region,3'-UTR)结合。已有文献报道在293T细胞中miR-139-5p能与IGF1R的3'-UTR结合。Western Blot方法检测预测IGF1R和IRS1在H9c2细胞中的蛋白表达情况,以验证H9c2心肌细胞中mi R-139-5p与预测靶基因的靶向关系。4.miR-139-5p过表达加重H9c2心肌细胞H/R损伤的机制研究Western Blot方法检测mi R-139-5p过表达的H9c2心肌细胞在H/R损伤条件下,细胞中总IGF1R(total IGF1R,t-IGF1R)、磷酸化IGF1R(phosphorylated IGF1R,p-IGF1R)、总IRS1(total IRS1,t-IRS1)、磷酸化IRS1(phosphorylated IGF1R,p-IRS1)、caspase3剪切体(Cleaved Caspase-3,Cl-caspase3)的表达。免疫荧光法检测细胞因子诱导的凋亡抑制因子1(cytokine induced apoptosis inhibitor 1,CIAPIN1)的细胞内定位的变化。结果:1.miR-139过表达重组慢病毒载体的构建及其稳定转染H9c2细胞系的建立miR-139过表达慢病毒载体构建成功。将其与空载体分别转染进H9c2心肌细胞后,细胞的生长状态良好,荧光视野中可见大量的GFP绿色荧光,经过嘌呤霉素筛选,最终荧光表达效率超过95%,提取细胞总RNA,qRT-PCR检测结果显示,与空载体组相比,过表达组miR-139-5p表达量明显上调(P0.01)。2.miR-139-5p过表达对H9c2心肌细胞H/R损伤的影响经过缺氧4 h/复氧2 h的处理之后,与NC组相比,NC+H/R组和miR-139-5p+H/R组细胞存活率明显下降(P0.001)、LDH活性显著升高(P0.01);与NC+H/R组相比,miR-139-5p+H/R组细胞存活率进一步降低(P0.01)、LDH活性升高更为明显(P0.001)。Hoechst33258染色结果显示,NC组细胞形态规则完整,细胞核染色均匀一致;NC+H/R组可见细胞核固缩浓染明显增多;miR-139-5p+H/R组亦有细胞核出现固缩凝聚,胞核致密浓染,细胞核分裂成碎片。3.miR-139-5p在H9c2心肌细胞中靶基因的预测和验证双荧光素报告基因检测表明在293T细胞中,mi R-139-5p可以抑制IRS1野生型质粒荧光素酶(Luciferase,luc)的表达(P0.05);但不影响IRS1的突变型质粒luc的表达(P0.05),提示miR-139-5p可以与IRS1的3'-UTR结合,IRS1可能是其靶基因。Western Blot方法检测发现,在H9c2心肌细胞中,miR-139-5p组的总IGF1R和总IRS1的蛋白表达较NC组明显减少(P0.05),提示在H9c2心肌细胞中IGF1R和IRS1是miR-139-5p的靶基因。4.miR-139-5p过表达加重H9c2心肌细胞H/R损伤的机制研究Western Blot结果显示,H/R后,与NC组比较,NC+H/R组p-IGF1R和p-IRS1降低(P0.001),p-IGF1R/t-IGF1R(P0.001)、p-IRS1/t-IRS1(P0.01)明显降低,Cl-caspase3明显升高(P0.05)。与NC+H/R组比较,miR-139-5p+H/R组t-IGF1R(P0.01)、t-IRS1(P0.05)的表达水平下降,p-IGF1R(P0.01)、p-IRS1(P0.001)降低,p-IGF1R/t-IGF1R和p-IRS1/t-IRS1进一步降低(P0.05),Cl-caspase3进一步升高(P0.05),提示miR-139-5p可能通过降低IGF1R和IRS1的磷酸化水平和增加Cl-caspase3水平加重H/R损伤。免疫荧光染色结果显示,正常培养条件下,NC组和miR-139-5p组细胞中的CIAPIN1均匀分布在细胞核周围及细胞浆中。H/R后,与NC组比较,NC+H/R组和miR-139-5p+H/R组的CIAPIN1均表现为向细胞核周围聚集,提示H/R可引起CIAPIN1的核转位,可能参与H/R损伤的调节。结论:1.miR-139过表达慢病毒转染H9c2心肌细胞,可获得稳定转染的细胞系。2.miR-139-5p过表达可加重H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤。3.IGF1R和IRS1是miR-139-5p在H9c2心肌细胞中靶基因。4.过表达miR-139-5p可能通过减少IGF1R和IRS1的磷酸化、抑制IGF1R/IRS1信号通路的激活、增加Cl-caspase3的表达而加重H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤。H/R可引起H9c2心肌细胞中的CIAPIN1核转位增加。


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