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RYR3、MiR-29b及MMP-9在小鼠动脉硬化斑块形成过程中的作用

郑晔  
【摘要】:目的:动脉粥样硬化性血管疾病的发生与钙通道的开启及激活密切相关,粥样硬化斑块形成之前,载脂蛋白E基因缺陷小鼠的血管平滑肌细胞内钙离子基线水平增加,我们通过建立E基因缺陷(ApoE基因-/-)动脉粥样硬化小鼠模型,观察主动脉血管平滑肌细胞中RYR3表达的变化,并阐明其与粥样硬化斑块的关系。我们应用Apo-e(-/-)小鼠模型,进行miR-29b在AS模型及正常血管中表达的差异的比较,并分析MMP-9在两组血管当中的表达情况的差异,进一步探讨miR-29b与MMP-9在动脉粥样硬化发生、发展过程中所起的作用,观察二者在动脉粥样硬化发展过程中的关联,为进一步认识动脉粥样硬化的机制寻找可靠的证据。方法:我们选取45只雄性ApoE敲除小鼠和45只野生型C57BL/6J小鼠均为7-8周龄雄性,体重19-21g。分别给予高脂饲料,喂养至20、27和33周龄时每组随机各取15只处死。分析载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中兰尼碱受体3(RYR3)的表达。选取7~8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠45只为模型组及野生型C57BL/6J小鼠45只为对照组,高脂饲喂至20、27和33周,取主动脉进行HF和Masson染色,计算斑块面积占管腔面积百分比和胶原成分占斑块面积百分比。应用油红O染色分析斑块脂质含量,免疫组织化学染色测定平滑肌细胞阳性表达RYR3的百分比,western blot定量分析RYR3在易损斑块形成过程中的表达。实验组(FS组)为45只7-8周龄净重在19-21g的雄性C57BL/6J(ApoE/-/)小鼠,另选取45只7-8周龄相同体重雄性级C57BL/6J小鼠作为本次实验的对照组(NS组)。测量20周后所有小鼠体重(WT),测血清中总胆固醇含量。我们通过苏丹Ⅳ染色来观察血管内膜脂纹形成情况,观察血管壁纤维化情况应用MASSON染色观察泡沫细胞及脂核或脂质池的形成情况应用及HE染色。应用荧光定量PCR技术检测miR-29b的表达/MMP-9的表达。对于MMP-9蛋白在血管各层的表达情况则采用免疫组化检测。结果:模型组20周龄小鼠有脂质斑块形成;27周龄载脂蛋白E基因缺陷小鼠能够观测到粥样斑块形成,明显的泡沫细胞堆积,斑块纤维帽变薄,部分斑块出现破裂;而33周龄的小鼠粥样硬化进展更加明显。而相比对照组20、27和33周龄小鼠无明显动脉斑块形成,血管中层VSMC未观测到显著变化通过Masson染色观测到动脉粥样斑块内的柳叶形胆固醇结晶随着模型组小鼠周龄的增加而逐渐增多[1]。高脂饲料喂养后,模型组的TC,TG和LDL-C水平显著高于对照组(P0.01),但HDL-C水平相似。RYR3蛋白表达水平与同龄对照组小鼠相比,ApoE基因敲除小鼠的RYR3表达明显不同,且随着模型组小鼠周龄增加,RYR3蛋白表达逐渐增加(P0.05)。苏丹Ⅳ染色:FS组主动脉内膜斑块状隆起处被染成猩红色,而NS组主动脉内膜比较光滑,未发现红染,仍表现为内膜本来的颜色。通过Masson染色我们观测到NS组主动脉血管内、中膜胶原纤维被染为淡蓝色;FS组血管内、中膜蓝色淡蓝胶原纤维与NS组相比明显减少,NS组主动脉弓miR-29b的表达较FS组明显升高,通过免疫组化图片观测到NS组主动脉血管内、中膜MMP-9表现为散在弱阳性表达,而MMP-9的内膜表达在FS组则明显增高,表现为强阳性,NS组主动脉弓MMP-9在蛋白水平及mRNA的表达较FS组都明显降低[2]。结论:ApoE基因敲除小鼠的血清胆固醇水平显著高于对照组,TC和LDL-C水平以及脂质面积也随着年龄的增加而上升。RYR3蛋白的异常表达和升高的血脂水平同时参与动脉粥样硬化斑块的形成。因此,RYR3参与动脉粥样硬化斑块形成的病理过程。在ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型中,动脉粥样硬化斑块的形成可能与动脉粥样硬化晚期MMP-9表达上升及miR-29b表达下降存在相关性。


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