缓释Ⅵ型胶原诱导巨噬细胞极化促进大鼠坐骨神经缺损再生的应用研究

【摘要】：目的:(1)Fmoc固相合成法合成RADA16-I自组装多肽,质谱鉴定并对其理化性质进行表征。静电纺丝制备PCL神经导管及对其力学性能进行测定。(2)采用RADA16-I自组装水凝胶包裹缓释Ⅵ型胶原,观察其在体外的释放曲线。采用Ⅵ型胶原诱导极化巨噬细胞,观察其体外极化巨噬细胞的效果。采用共培养模型,研究极化后的巨噬细胞对雪旺细胞增殖及功能的影响。(3)探讨RADA16-I自组装水凝胶包裹缓释Ⅵ型胶原填充PCL神经导管修复长节段大鼠坐骨神经缺损的效果。方法:(1)采用Fmoc固相合成法合成RADA16-I自组装多肽。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对合成的多肽进行纯化。采用~1H NMR核磁共振对合成及纯化后的小分子化合物RADA16-I进行表征。红外光谱检测化合物的红外吸收。透射电镜观察水凝胶纤维形貌。自组装水凝胶的流变性质采用流变仪进行检测。静电纺丝制备PCL神经导管,扫描电镜对PCL导管进行观察及测量纤维丝平均直径,改良比重法测量孔隙率并用小量程力学拉伸测量仪对其应力-应变曲线进行测定,计算杨氏模量、最大应力、最大载荷和最大断裂张力。(2)制备含有0.1%Ⅵ型胶原与1%RADA16-I混合液,室温静置以后制得混合水凝胶。取25ul的水凝胶填充于PCL支架中,置入PBS中,于0.5、1、2、3、4、5、6、7、14、28、56天时间点分别收集培养孔的上清液。采用ELISA法检测Ⅵ型胶原累积释放比率。分离、纯化、鉴定雪旺细胞。将大鼠RAW264.7巨噬细胞接种在24孔板中,每孔加入含0.1%Ⅵ型胶原的RPMI1640低糖培养基,培养及干预72小时后,采用CD68、CCR7、iNOS、CD206和CD163鉴定巨噬细胞相关表型。将Ⅵ型胶原诱导巨噬细胞极化后的培养液与新鲜的DMEM/F12培养基以1:1的比例混合,进行雪旺细胞的培养,建立不同极化状态巨噬细胞与雪旺细胞共培养模型,干预5天后用CCK-8检测雪旺细胞增殖。采用RT-PCR检测共培养条件下对雪旺细胞GDNF、NGF、NT3和MBP mRNA的表达。(3)制备含有0.1%Ⅵ型胶原与1%RADA16-I的混合水凝胶,填充17mm PCL神经导管并桥接大鼠坐骨神经15mm长节段缺损。采用单纯RADA16-I水凝胶填充PCL导管和自体神经移植作为参照。术后第3、14天时,免疫荧光染色显示巨噬细胞分化情况。在术后4、8、12周时,采用坐骨神经指数、电生理检测、免疫荧光、再生神经及肌肉形态学分析评估大鼠神经再生效果。结果:(1)RADA16-I的出品率为85.6%,RADA16-I自组装多肽形成水凝胶后,红外光谱峰值发生位移,以离子键互补的方式形成水凝胶。RADA16-I浓度的提高,其成胶的温度上升。RADA16-I浓度提高,成胶pH值有所上升。(2)Ⅵ型胶原释放的周期很长,长达56天。但在前6天时其释放比率较大,0.5 days:32.3±3.1%;1 days:38.2±4.1%;2 days:43.1±3.8%;3 days:47.8±5.7%;4 days:52.5±6.1%;5 days:56.0±5.2%;6 days:62.2±4.5%。在第6天到第56天之间,其释放逐渐放缓,7 days:65.1±5.3%;14 days:71.6±5.0%;28 days:78.8±4.1%;56days:98.7±0.8%。S100和Sox10荧光双标染色鉴定雪旺细胞纯度高达96.3%。经过VI型胶原72h的诱导极化后,M2型巨噬细胞所占CD68+细胞比例高达55.2%。Ⅵ型胶原极化组共培养模型下的雪旺细胞增殖在培养第3、5天时均显著高于对照组(P0.05)。极化后的巨噬细胞培养液能够显著的促进雪旺细胞高表达GDNF、NGF、NT3和MBP mRNA,均显著高于对照组(P0.05)。(3)支架植入术后3天和14天PCL组的M1巨噬细胞的比例(CCR7+/CD68+or iNOS+/CD68+)明显高于PCL/CollagenⅥ组(P0.05)。支架植入术后3天和14天PCL/CollagenⅥ组M2巨噬细胞的显示比例(CD206+/CD68+or CD163+/CD68+)明显高于PCL组(P0.05)。PCL/Collagen VI组的再生轴突面积、有髓轴突数量、髓鞘直径、G-ratio及髓鞘厚度在3个时间点均显著优于PCL组(P0.05)。在12周时,有髓轴突数量和G-ratio在自体神经组和PCL/Collagen VI组之间无显著差异(P0.05)。免疫荧光显示PCL/Collagen VI组的神经纤维及雪旺细胞较为有序的排列生长,可见雪旺细胞沿着轴突生长方向包裹,其也显示了较好的再生效果。PCL/Collagen VI组和自体神经组感觉及运动神经元数量、坐骨神经指数、CMAP、神经传导速度及CMAP潜伏期均显著优于PCL组(P0.05),但PCL/Collagen VI组和自体神经组在上述指标中均无统计学差异(P0.05)。肌肉染色分析也显示PCL/Collagen VI组肌肉纤维直径明显优于PCL组(P0.05),PCL/Collagen VI组和自体神经组的肌肉纤维直径无统计学差异(P0.05)。结论:(1)本研究成功的制备了RADA16-I多肽,其能够在生理条件下自组装形成水凝胶,能够满足外源性蛋白的包裹要求。PCL电纺导管力学性能可满足大鼠体内神经再生要求。(2)RADA16-I水凝胶能够有效的包裹和缓释VI型胶原,其缓释曲线与体内巨噬细胞招募、迁移时间相似,能够更好的在体内应用。VI型胶原在体外能够有效的诱导极化巨噬细胞向M2型转化,并且其能够促进雪旺细胞生物学功能。(3)RADA16-I水凝胶包裹缓释VI型胶原能够在体内有效极化巨噬细胞向M2型转化,并且有效的提高神经再生质量和运动功能恢复水平。