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间断PTH治疗对PMOP妇女循环MSCs的影响及促进BMSCs成骨分化的机制研究

唐玉涛  
【摘要】:绝经后骨质疏松症(PMOP)是最常见的骨质疏松症之一,目前治疗PMOP的药物主要包括抑制骨吸收药物,如双膦酸盐类,和促骨合成药物,如特立帕肽(PTH1-34)。间断PTH(1-34)治疗能促进骨形成,但其作用机制尚未完全阐明。间充质干细胞(MSCs)是一种具有多向分化潜能的多能干细胞,主要存在于骨髓中(BMSCs),在一些疾病状态下,骨髓中的MSCs能够被募集进入血液,随循环到达疾病部位参与疾病应答及组织损伤的修复,循环MSCs对于PMOP的治疗具有潜在意义,目前研究证实,PMOP病人体内MSCs数量减少,成骨活性降低,间断PTH(1-34)治疗对PMOP病人外周血中循环MSCs的影响尚未见报道。PTH(1-34)能促进BMSCs成骨分化,但其机制尚有待研究,自噬是真核细胞中的一种细胞内降解系统,自噬功能障碍与多种疾病有关,越来越多的研究表明自噬在维持骨稳态方面发挥着重要作用,自噬在PTH(1-34)诱导的BMSCs成骨分化中的作用目前尚未见研究报道。本课题将分为以下三部分对上述问题进行研究:第一部分研究目的:间断PTH(1-34)治疗对PMOP患者外周血中循环MSCs数量的影响。研究方法:收集54例未经治疗的PMOP患者,随机分为两组分别接受特立帕肽和阿仑膦酸盐治疗12个月,于第0,1,3,6,12个月抽取病人外周全血标本,流式细胞检测外周血中循环MSCs数量变化,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中骨代谢指标变化,双能X线吸收法(DXA)检测病人腰椎、股骨颈、全髋骨密度值,比较两组病人各项指标的统计学差异。研究结果:流式细胞检测结果表明,PMOP患者在接受PTH(1-34)治疗1个月,外周血中的循环MSCs数量明显升高,与治疗前相比增加141±96%(P0.001),且持续至第12个月;而阿仑膦酸盐组MSCs数量在治疗期间无明显变化。Pearson相关性分析显示:PTH组病人循环MSCs数量的增加与血清骨转换指标及腰椎BMD的变化呈明显正相关(P1NP:r=0.67,P0.001;OCN:r=0.54,P=0.003;β-CTX:r=0.57,P=0.002;腰椎BMD:r=0.61,P=0.01)。研究结论:间断PTH(1-34)治疗能增加PMOP患者外周血中循环MSCs的数量,且MSCs数量的增加与骨代谢指标及BMD的变化呈明显正相关,说明增加的MSCs可能参与骨重建。第二部分研究目的:间断PTH(1-34)治疗对PMOP患者循环MSCs成骨分化能力的影响。研究方法:从第一部分接受PTH(1-34)治疗的PMOP病人中随机选择6位,分别在开始治疗前以及接受PTH(1-34)治疗1个月时抽取外周静脉血,分离MSCs,经成骨分化诱导培养后,通过碱性磷酸酶染色及活性分析,Alizarin red染色钙结节,RT-PCR检测Runx-2,OSX,COL-1a1,和OCN mRNA的表达,比较两组细胞成骨活性的差异。研究结果:PTH(1-34)治疗组MSCs碱性磷酸酶活性、染色的细胞数量、钙沉积量均较对照组明显增加,RT-PCR结果显示PTH(1-34)组细胞成骨相关基因Runx-2,OSX,COL-1a1,和OCN mRNA的表达水平均较对照组明显升高。研究结论:间断PTH(1-34)治疗后PMOP患者外周血中循环MSCs成骨分化能力增加。第三部分研究目的:研究自噬在间断PTH(1-34)促进BMSCs成骨分化中的作用机制。研究方法:选取10例在我院骨科接受脊柱手术的女性患者,其中5例为PMOP患者,5例为正常患者(无骨质疏松),在术中取髂骨块植骨时,顺便以骨穿针于取骨伤口处抽吸骨髓,从其中分离BMSCs进行体外培养。1.两组细胞自噬活性与成骨分化能力比较:Western blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1、P62和LC3的表达,免疫荧光检测细胞内LC3-II的表达;成骨诱导21天后检测ALP活性,Western blot检测成骨相关蛋白的表达,RT-PCR检测成骨活性相关基因的表达。2.PTH(1-34)对BMSCs自噬活性的影响:取PMOP患者骨髓来源的BMSCs,分为4组,分别用PTH(1-34)(PTH组)、雷帕霉素(RAP组)、PTH(1-34)和雷帕霉素(PTH+RAP组)及PBS(对照组)处理细胞,检测各组细胞的自噬活性和成骨分化能力。3.AMPK/mTOR/ULK1通路介导的自噬在PTH(1-34)诱导的BMSCs成骨分化中的作用:取PMOP患者骨髓来源的BMSCs分为三组,分别用PTH(1-34)(PTH组)、PTH(1-34)和AMPK抑制剂Compound C(PTH+CC组)及PBS(对照组)处理细胞,Western blot检测三组细胞AMPK/mTOR/ULK1通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTPR、ULK1、p-ULK1表达情况,并比较各组细胞自噬活性与成骨分化能力。研究结果:1.与正常组相比,PMOP患者骨髓来源的BMSCs自噬活性与成骨分化能力明显降低。2.与对照组比较,PTH、RAP及PTH+RAP组BMSCs自噬活性和成骨分化能力均明显增加。3.与对照组比较,PTH组p-AMPK、p-ULK1表达增加,而p-mTPR表达降低;而PTH+CC组,p-AMPK、p-ULK1表达较PTH组下降,而p-mTPR表达升高,PTH+CC组BMSCs自噬活性和成骨分化能力较PTH组均降低。研究结论:PMOP患者BMSCs自噬活性降低,体外间断PTH(1-34)刺激通过诱导AMPK/mTOR/ULK1通路介导的自噬促进BMSCs成骨分化。


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