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重组人TSH受体中试发酵工艺初步探索和人血清TRAb化学发光酶免疫分析试剂盒的研制及临床检测

李宁  
【摘要】:自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease,AITD)是一类多发病,包括格雷夫氏病(Graves disease,GD)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)和特发性粘液性水肿等。GD是甲状腺毒症最常见类型(约占85%),是一种伴甲状腺激素分泌增多的器官特异性自身免疫性疾病。促甲状腺激素受体(TSH receptor,TSHR)是GD最重要的致病抗原,病理条件下TSHR成为自身抗原刺激机体产生TSHR抗体(thyrotropin receptor antibody,TRAb),TRAb是GD的病因,在GD的发病、发展和转归中起重要作用。TRAb属于异质性多克隆抗体,根据其与TSHR结合后产生的效应不同分为甲状腺刺激性抗体(thyroid stimulating antibody,TSAb)和甲状腺刺激阻断性抗体(thyroid stimulating blocking antibody,TSBAb)。TSAb与TSHR结合后模拟TSH的作用,通过激活腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷(AC-cAMP)通路,刺激甲状腺滤泡细胞生长和甲状腺激素合成、分泌,导致甲状腺机能亢进(甲亢)。TSBAb与TSHR结合后可阻断TSH对甲状腺的刺激作用,可引起甲状腺机能减退(甲减)的发生。人TSHR属于G蛋白偶联受体,包括细胞膜外区(TSHR-ecd)、跨膜区和细胞膜内区三部分,TSAb的结合靶点主要集中在TSHR-ecd的氨基端(TSHRn),TSBAb的结合靶点主要集中在TSHR-ecd羧基端(TSHRc)。本室前期研究将TSHR-ecd分段表达,在TSHR-ecd氨基端筛选并克隆出主要与TSAb结合的TSHR抗原决定簇集中区基因重组质粒(pET102/D-hTSHRn462bp),原核表达获得了主要与人血清TSAb结合的硫氧还蛋白-人促甲状腺激素受体膜外区氨基端片段融合蛋白(TrxFus-hTSHRn),TrxFus-hTSHRn是TSAb结合靶抗原。以上研究获得了国家发明专利“人促甲状腺激素受体胞外区氨基端基因表达产物及其制备方法和该产物在酶免技术中的应用”(专利号:ZL 200610015383.5)。同时,在TSHR-ecd羧基端筛选并克隆出主要与TSBAb结合的TSHR抗原决定簇集中区基因重组质粒(pET102/D-hTSHRc405bp),原核表达获得了主要与人血清TSBAb结合的硫氧还蛋白-人促甲状腺激素受体膜外区羧基端片段融合蛋白(TrxFus-hTSHRc),TrxFus-hTSHRc是TSBAb结合靶抗原。化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)是将具有高灵敏度的化学发光技术与高特异性的酶免疫分析技术相结合,用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、药物等的检测分析技术,是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术,主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单等优点。目的:本研究探索重组人TSHR膜外区氨基端蛋白和羧基端蛋白中试发酵工艺,提高抗原产量,应用中试发酵表达的人TSHR膜外区氨基端抗原融合蛋白TrxFus-hTSHRn(TSAb结合靶抗原)开发以检测人血清TSAb为主的TRAb化学发光酶免疫分析(人血清TRAb/TSAb-CLEIA)试剂盒,以羧基端抗原融合蛋白TrxFus-hTSHRc(TSBAb结合靶抗原)开发以检测人血清TSBAb为主的TRAb化学发光酶免疫分析(人血清TRAb/TSBAb-CLEIA)试剂盒,并用于临床检测,考察其对AITD诊断、鉴别诊断、疗效观察和预后的临床应用价值。方法:1.重组人TSHR膜外区氨基端蛋白和羧基端蛋白中试发酵表达工艺探索将本室构建的重组表达质粒pET102/D-hTSHRn462bp和pET102/D-hTSHRc405bp分别转入表达菌E.Coli BL21 Star~(TM)(DE3),将菌接种至5ml 2×YT液体培养基中,37℃200rpm摇菌过夜后为一级种子。将一级种子转移至200ml 2×YT液体培养基中,37℃200rpm继续摇菌制备二级种子,将二级种子按5%的接种量接种于5升发酵罐培养基中,探索优化5升中试发酵条件:发酵温度、pH、溶氧、诱导剂浓度、诱导时间等。表达包涵体产物经变性Ni~(2+)-NTA(镍-氮川乙酸)亲和层析纯化,梯度透析复性,获得重组TrxFus-hTSHRn和TrxFus-hTSHRn,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定分子量和纯度,蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定重组抗原免疫活性,计算中试发酵产率。2.人血清TRAb化学发光酶免疫分析试剂盒的研制将中试发酵的重组TrxFus-hTSHRn(TSAb结合靶抗原)蛋白包被化学发光微孔板,自制的人TRAb(以WHO TRAb参考制剂(WHO NIBSC 90/672)为标准进行校准)为校准品,辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为标记抗体,鲁米诺为发光底物,研制人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒;将中试发酵的重组TrxFus-hTSHRc(TSBAb结合靶抗原)蛋白包被化学发光微孔板,自制的人TSBAb为内部校准品,辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为标记抗体,鲁米诺为发光底物,研制人血清TRAb/TSBAb-CLEIA试剂盒。检测试剂盒实验条件的优化:(1)抗原包被缓冲液(2)抗原包被量和待测血清稀释度正交实验(3)反应时间等。方法学评价指标:(1)最低检测限(2)特异性(3)精密度(4)准确度(5)健全性(6)参考区间等。临床试验研究:人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒与英国RSR TRAb 2~ndd generation ELISA试剂盒进行临床对比,进行一致性分析和相关性分析。3.人血清TRAb化学发光酶免疫分析试剂盒的临床检测人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒检测597例甲状腺病患者和120例健康人,人血清TRAb/TSBAb-CLEIA试剂盒检测416例甲状腺病患者和120例健康人。甲状腺病患者分组情况:(1)GD活动期伴甲亢组:123例(男45例,女78例,年龄16-63岁,平均年龄48.4岁);(2)GD治疗3-12月组:86例(男37例,女49例,年龄28-66岁,平均年龄41.0岁);(3)GD治疗12-18月组:116例(男46例,女70例,年龄30-65岁,平均年龄42.1岁);(4)GD治疗18-24月组:74例(男33例,女41例,年龄26-68岁,平均年龄53.7岁);(5)HT甲减组:101例(男28例,女73例,年龄24-75岁,平均年龄50.1岁);(6)HT甲功正常组:95例(男36例,女59例,年龄35-69岁,平均年龄52.2岁);(7)结节性甲状腺肿组:62例(男25例,女37例,年龄24-60岁,平均年龄47.9岁);(8)亚急性甲状腺炎组:35例(男17例,女18例,年龄23-65岁,平均年龄42.0岁)。4.数据分析使用SPSS11.0统计软件进行统计分析。数据进行正态性检验,数值变量资料为正态分布时,以“均数±标准差”((?)±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),各组阳性率比较采用卡方检验(χ~2检验)。P0.05为差异有统计学意义。结果:1.重组人TSHR膜外区氨基端蛋白和羧基端蛋白中试发酵表达工艺探索人TSHR氨基端重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn 5升中试发酵最优条件为:诱导剂IPTG浓度1.0 mmol/L,诱导温度30℃,诱导时间6小时,培养物pH 7.0,溶氧10%。重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn分子量约为38KD,纯度95.8%,与人血清TSAb结合免疫活性良好,5升中试发酵产率为52.3-61.8mg/L培养基,单次发酵可生产约18000-21600盒(96人份/盒)检测试剂。人TSHR羧基端重组融合蛋白TrxFus-hTSHRc 5升中试发酵最优条件为:诱导剂IPTG浓度1.0 mmol/L,诱导温度30℃,诱导时间6小时,培养物pH 7.0,溶氧20%。重组融合蛋白TrxFus-hTSHRc分子量约为28.9KD,纯度97.5%,与人血清TSBAb结合免疫活性良好,5升中试发酵产率为67.3-81.6 mg/L培养基,单次发酵可生产约23500-28500盒(96人份/盒)检测试剂。2.人血清TRAb化学发光酶免疫分析试剂盒的开发2.1人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒的研制2.1.1优化后的实验条件TrxFus-hTSHRn抗原用碳酸盐缓冲液(CBS,pH9.6)稀释后包被微孔板100ng/孔,4℃过夜;待测样品血清稀释度1:100,37℃温育60分钟;HRP标记羊抗人IgG二抗稀释度1:4000,37℃温育30分钟。2.1.2校准曲线将自制的人TRAb以WHO TRAb参考制剂(WHO NIBSC 90/672)为标准对照品进行标定赋值,并结合临床建立标准曲线为1 IU/L,2 IU/L,7 IU/L,22IU/L,72 IU/L。2.1.3方法学评价(1)最低检测限:0.06 IU/L。(2)特异性:与TgAb、TPOAb交叉反应率均小于0.5%。(3)精密度:高、中、低浓度血清批内(n=12)变异系数(CV%)分别为5.0%、4.8%、5.7%。批间(n=12)变异系数(CV%)分别为4.7%、5.5%、5.4%。(4)准确度:测定高、中、低浓度样品回收率分别为95.3%、106.3%、91.6%。(5)健全性:血清样品TSAb稀释后的理论浓度与实测浓度的比值均在90%-110%标准范围内,血清样品稀释倍数与测定浓度成直线关系(r=0.9999),健全性好。(6)参考区间:用人血清TRAb/TSAb-CLEIA检测120例健康人血清TRAb(以TSAb为主)浓度为((?)±s)2.31±0.82 IU/L,以x+2s(95%可信区间)即4 IU/L为Cutoff值。人血清TRAb(以TSAb为主)浓度4 IU/L为阴性,4 IU/L为阳性。2.1.4临床试验研究人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒与RSR TRAb 2~(nd) generation ELISA试剂盒检测,(1)一致性分析:阳性符合率:96.6%(141/146),阴性符合率:94.2%(81/86),总体符合率:96.5%(222/230)。(2)相关性分析:回归方程:y=0.6+0.988x,相关系数r=0.983,两种试剂检测结果高度相关,符合率较好。2.2人血清TRAb/TSBAb-CLEIA试剂盒的研制2.2.1最佳实验条件TrxFus-hTSHRc抗原用CBS缓冲液(pH9.6)稀释后包被微孔板100ng/孔,4℃过夜;待测样品血清稀释度1:100,37℃温育60分钟;HRP标记羊抗人IgG二抗稀释度1:6000,37℃温育30分钟。2.2.2校准曲线以自制的人TSBAb建立的标准曲线为10AU/L,20AU/L,40AU/L,80AU/L,160AU/L。2.2.3方法学评价(1)最低检测限:0.15AU/L。(2)特异性:与TgAb、TPOAb交叉反应率均小于4%。(3)精密度:高、中、低浓度血清批内(n=12)变异系数(CV%)分别为5.02%、4.67%、7.05%。批间(n=12)变异系数(CV%)分别为5.34%、2.82%、4.07%。(4)准确度:测定高、中、低浓度样品回收率分别为96.8%、98.0%、104.0%,平均回收率99.6%。(5)健全性:血清样品TSBAb稀释后的理论浓度与实测浓度的比值均在90%-110%标准范围内,血清样品稀释倍数与测定浓度成直线关系(r=0.9999),健全性好。(6)参考区间:用人血清TRAb/TSBAb-CLEIA检测120例健康人血清TRAb(以TSBAb为主)浓度为((?)±s)10.77±1.61AU/L,以x+2s(95%可信区间)即14 AU/L为Cutoff值。人血清TRAb(以TSBAb为主)浓度14 AU/L为阴性,14AU/L为阳性。3.人血清TRAb化学发光酶免疫分析试剂盒的临床检测3.1人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒临床检测人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒用于597例甲状腺病患者和120例健康人临床检测,结果如下:(1)GD活动期伴甲亢组血清TSAb浓度和阳性检出率均显著高于各GD治疗组、HT甲减组、结甲肿组、亚甲炎组和健康人组(P均0.01)。(2)GD患者治疗过程中血清TSAb浓度显著下降,GD活动期伴甲亢组、GD治疗3-12个月组、GD治疗12-18个月组和GD治疗18-24个月组间差别有统计学意义(F=6.391,P=0.001)。GD治疗18-24个月组TSAb仍高于健康对照组(F=3.272,P=0.002)。与此同时,GD患者TSAb阳性检出率也明显下降,GD治疗3-12个月组、GD治疗12-18个月组和GD治疗18-24个月组TSAb阳性率显著降低(66.71%vs.36.03%vs.18.27%,χ~2=63.02,P=0.000),但仍高于健康人(2.88%,P=0.02)。(3)结甲肿、亚甲炎患者血清TSAb浓度和阳性率均与健康人无统计学差异(F=1.346,P0.05;F=1.015,P=0.09)。(4)HT甲减患者血清TSAb浓度和阳性率均显著高于非AITD的结甲肿组、亚甲炎组、健康人组(F=3.008,P=0.024;F=4.791,P=0.000)。3.2人血清TRAb/TSBAb-CLEIA试剂盒临床检测人血清TRAb/TSBAb-CLEIA试剂盒用于416例甲状腺病患者和120例健康人临床检测,结果如下:HT甲减组、HT甲功正常组TSBAb浓度和阳性率均显著高于其它各组(F=7.366,P=0.001;χ~2=43.75,P=0.008)。GD活动期伴甲亢组与结甲肿组、亚甲炎组、健康对照组血清TSBAb浓度无统计学差异(F=2.39,P=0.12),但阳性率高于上述三组(χ~2=27.11,P=0.03)。结论:1.探索人TSHR膜外区氨基端蛋白和羧基端蛋白5升中试发酵条件,获得的重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn和TrxFus-hTSHRc纯度高(分别为95.8%和97.5%)、免疫活性好、产率高(产率分别为52.3-61.8mg/L培养基和67.3-81.6mg/L培养基),单次发酵可生产约20000-25000盒(96人份/盒)检测试剂,满足试剂盒产业化生产的要求,为开发人血清TRAb化学发光酶免疫分析试剂盒奠定了原料基础。2.人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒采用TSAb结合靶抗原(TrxFus-hTSHRn)包被,检测以TSAb为主的TRAb。人血清TRAb/TSBAb-CLEIA试剂盒采用TSBAb结合靶抗原(TrxFus-hTSHRc)包被,检测以TSBAb为主的TRAb。上述试剂盒灵敏、特异、稳定,操作简便,性能技术指标优良,适于临床常规检测。3.TSAb可作为GD甲亢病因诊断、判断停药时机、预测复发的最佳免疫学指标之一,人血清TRAb/TSAb-CLEIA试剂盒对GD甲亢诊断、疗效监测、判断停药时机、评估复发及预后等有重要临床应用价值。TSBAb可作为HT甲减辅助诊断、疗效观察的免疫指标。人血清TRAb/TSBAb-CLEIA试剂盒对HT辅助诊断、疗效评估和预后有重要临床应用价值。


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