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FTL在免疫相关性血细胞减少症发病机制中作用的研究

张洋  
【摘要】:目的:在前期SEREX法筛选出免疫相关性全血细胞减少症(immuno-related pancytopenia,IRP)可能抗原铁蛋白轻链(Ferritin light chain,FTL)的基础上,进一步筛选与鉴定FTL的抗原表位,并将FTL与指标进行相关性分析,从而验证FTL在IRP中的抗原性。内容:分别纯化IRP患者与健康人血清抗体,应用噬菌体随机肽库亲和筛选出噬菌体阳性斑测序,与铁蛋白轻链序列比对,并联合T细胞表位预测软件,筛选出FTL可能抗原表位,合成抗原肽。Elispot筛选出能被Th2细胞识别,而不被Th1细胞识别的FTL的抗原肽;分别在FTL水平、FTL-mRNA水平分析IRP病例组和对照组的差异;同时分析T、B淋巴细胞免疫状态,并与临床指标进行相关性分析。方法:1、筛选FTL抗原表位,合成抗原肽。将IRP患者与健康人血清抗体提纯,应用噬菌体随机肽库进行亲和筛选,结合ELISA挑取能与IRP患者血清抗体结合,而不能与健康人血清抗体结合的噬菌体阳性克隆测序、将测序结果与FTL序列比对,同时利用T细胞表位预测软件预测FTL与MHC-Ⅱ分子结合抗原表位(15肽),合成肽段序列为VNLYLQASYTYLSLG作为后续酶联免疫斑点试验(ELISPOT)的阳性肽段。2、ELISPOT检测抗原肽对Th2细胞作用。应用淋巴细胞分离液提取IRP初治患者外周血单个核细胞(PBMNCs)并-80℃冰箱储存,待使用前复苏,检测细胞存活率。将复苏的PBMCs准确计数并分别放入IL-4 Elispot、IFN-γElispot中培养48h后上机检测。3、IRP初治及恢复组FTL水平检测及其与临床指标关联采用流式细胞术检测初治IRP、恢复期IRP以及病例对照组骨髓单个核细胞膜FTL表达,ELISA方法分别检测初治组、恢复组IRP患者以及正常对照血清中FTL浓度,WB检测初治IRP患者、恢复期IRP患者以及病例对照组骨髓单个核细胞FTL蛋白表达水平,并且用Q-PCR方法检测初治IRP患者、恢复期IRP患者以及病例对照组骨髓单个核细胞FTL-mRNA表达量。将上述指标、IRP患者的T、B细胞免疫状态及其他临床指标进行相关分析。结果:1.我们成功应用噬菌体随机肽库进行亲和筛选,结合ELISA挑取噬菌体阳性克隆测序,与铁蛋白轻链序列比对,并联合T细胞表位预测软件,筛选出FTL可能阳性抗原表位(多肽1):VNLYLQASYTYLSLG及阴性肽段(多肽2):IKKPAEDEWGKTPDA。2.本实验通过ELISPOT技术,发现多肽1:VNLYLQASYTYLSLG能明显刺激IL-4产生,不能刺激IFN-r产生,而多肽2:IKKPAEDEWGKTPDA不能刺激IL-4的产生,提示多肽1能明显激活Th2细胞,留取多肽1进行后续实验。3.1)本实验通过FCM发现IRP初治组骨髓单个核细胞膜FTL表达水平(4.62±4.61)高于病例对照组(0.68±0.46),差异具有统计学意义;ELISA法检测初治组和恢复组血清FTL水平(954.85±743.34)ng/ml及(303.22±300.79)ng/ml高于正常对照组(70.46±82.63)ng/ml,差异具有统计学意义(P0.05);Q-PCR法检测初治组、恢复组、病例对照组骨髓单个核细胞FTL-mRNA表达水平分别是(2.00±1.30)、(1.27±0.65)和(1.10±0.49),与病例对照组相比,IRP初治组FTL-mRNA水平明显升高,差异有统计学意义。WB发现FTL蛋白水平IRP初治组明显高于病例对照组。2)IRP患者T、B淋巴细胞免疫状态及与临床指标相关性分析:IRP初治组CD3+CD4+/CD3+(%)、CD3+CD4+/CD3+CD8+(%)、CD19+/PBMCs(%)细胞比例及细胞因子IL-6、IL-10表达水平均高于病例对照组,差异具有统计学意义,初治组和恢复组、恢复组和病例对照组比较差异无统计学意义。IRP初治组和恢复组外周血CD5+CD19+/CD19+(%)细胞比例及细胞因子IL-4表达水平高于对照组,差异具有统计学意义,初治组与恢复组差异无统计学意义;IRP初治组、恢复组、病例对照组外周血IL-2、TNF-α、IFN-γ水平比较,差异无统计学意义。CD5+CD19+/CD19+与补体C4成负相关;CD5+CD19+/CD19+与HBe Ab成正相关;IL-4与Ig A、抗链O成正相关;IL-6与C-反应蛋白(CRP)、HBe Ag、铁蛋白(Fer)成正相关。FTL-mRNA水平与抗链O(ASO)成正相关。ELISA法检测FTL水平与RBC、PLT成负相关,与铁蛋白、C反应蛋白(CRP)、乙肝e抗原成正相关。结论:1.FTL是部分IRP患者抗骨髓细胞膜抗体针对的“靶抗原”。2.VNLYLQASYTYLSLG多肽是“靶抗原”表位。3.该靶抗原在IRP患者骨髓造血细胞异常过度表达且与病情相关。4.阻断该靶抗原表位表达,有下调Th2激活趋势。


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