衰老相关基因的筛选及针刺干预作用的实验研究

【摘要】： 随着世界人口老龄化问题的日益严重，与衰老相关的心、脑疾病已成为人类 死亡的主要因素，其中老年期痴呆是发生于老年人的常见病和疑难病，目前该病 已成为第四位死亡原因，并呈进一步上升趋势，不仅严重地危害老年人的健康和 生活质量，而且给家庭及整个社会都带来沉重的经济负担和精神痛苦，因此，衰 老和抗衰老研究是当今医学及生物学领域的热门课题。 目前，人们以线虫、果蝇、转基因动物、培养细胞、甚至早老性疾病患者， 如Werner综合症等为对象研究衰老机理，发现了一些衰老相关基因，使衰老研 究有了很大进展，然而，由于缺乏能够模拟衰老自然发生的动物模型，因此，衰 老特别是抗衰老研究仍有很多空白之处。 我院于1993年引进国际公认的日本SAM快速老化模型鼠，其中SAM—P/10 以脑萎缩为特征随增龄出现老化诸特征，是与人类老化基本一致的自然发病快速 老化动物模型。本文以SAM-P/10为材料，将其分为P/10 1月龄组、P/10 7月龄 组、P/10 7月龄针刺穴位组、P/10 7月龄针刺非穴组，并以同源对照R系作对照 组，采用mRNA差别显示技术，通过银染显示差示带，筛选脑老化相关基因并 研究“调神益智，平肝通络”针法对衰老的干预作用，主要结果如下： 1．差示PCR采用双温扩增法，首先在较低的温度（37℃）退火，保证引物与 模板配对，进行3个循环，然后将退火温度升高到50℃，保证特异性扩增，通过 银染显示差示带，并直接从凝胶上切带进行洗脱和再扩增，既方便又避免了放射 自显影对环境及人体的污染，实验证明这种方法简单易行，并具有较好的特异性 和重复性。 2．通过随机引物两两随机组合进行扩增，共筛选了42个引物，其中一些引物 扩增出规律性变化的差示带，这些差示带伴加龄发生了或增加或减少的变化，相 同分子量和变化规律的差示带用其他引物也得到了重复，证明SAM-P/10的快速 脑老化可能与衰老相关基因的异常表达有关。 3．差示结果显示，伴加龄变化的差示带在针刺后其表达量发生了明显的变化， 首次证明“调神益智，平肝通络”针法可以干扰某些衰老相关基因的表达，并可 能通过此种方式延缓衰老进程，为研究针刺抗衰老机理探索了新的途径。 4．首次证实针刺可在分子水平上发挥其良性调节作用，即对衰老时高表达的 身 基因有下调作用，对低表达基因有上调作用，而且这种调节作用均使其表达趋同 于年轻组，从分子水平上证实针刺的根本作用是凋节作用，具有整体性特点。 5．实验结果还显示针刺穴位和非穴位，对基因表达水平的影响不同，穴位组 ，，。＿＿。。＿＿。。、．。＿。。。。。。。＿＿＿＿＿＿＿，＿＿＿＿＿，。＿。。＿，，。。 甲 作用更明显更强烈，具有较明显的干预衰老的作用，证实穴位在分子水平上也具 有相对特异性。 6．对部分差示带进行克隆，测序及同源性分析表明，三个cDNA片断与己知 序列同源性很低，可能是新的CDNA。另有一CDNA片断，slobp 与真核生物 翻译起始因子eIF3高度同源，与小鼠的eIF3同源性高达98％，与人eIF3同源性 高达89％；另外，还有 116 hp与编码人线粒体蛋白核基因elF3有93％同源性， NOrthern杂交分析进一步表明该片断为差异表达基因。因此认为eIF3很可能与衰 老相关，并受针刺影响。这是首次发现eIF3的衰老相关性，推测衰老可能是e！F3 异常表达导致蛋白质合成异常，进而造成正常机体功能逐渐失常的结果，而针刺 可能通过调节eIF3而减少蛋自质异常合成，从而起到延缓衰老的作用，本研究 为进一步研究针刺抗衰老机理开拓了思路。