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大规模生产冰核蛋白制品及冰核活性基因的扩增研究

刘静  
【摘要】:研究的意义:由于冰核细菌在许多方面都有着广阔的应用前景,因此大规模生产冰核活性蛋白,扩增冰核活性基因,用于含冰核基因检测,能够具有很好的经济前景和社会效益。 研究的方法:(1)使用发酵法依次在摇瓶水平、5L罐及30L罐水平上,对完善培养基配方,提高冰核活性细菌生物量进行了研究,并且使用机械破碎和化学抽提的方法实现较大量的提取冰核活性蛋白。(2)使用PCR扩增技术对冰核细菌冰核活性基因的体外扩增体系和扩增条件进行了初步的研究。 本论文分别使用Xanthomonas ampelinaTS206和Erwinia herbicola(A25)作为实验用菌种,主要研究内容有以下几个方面:(1)在摇瓶水平的实验中发现转速是获得较高生物量和较低副产品黄原胶的关键因素,对于细菌生物量来说,影响程度大小的顺序依次为转速装液量培养基的糖浓度。对细菌的产黄原胶量来说,影响程度大小的顺序依次为转速培养基的糖浓度装液量。在调整后的培养基条件下,菌体发酵粘度有大幅度下降,且产黄原胶能力不强,虽然发酵结束后,菌体生物量有所下降,但胶量/菌量的值较大幅下降,且降低了发酵液处理的难度。(2)采用超声波破碎和TritonX-100抽提相结合,建立了适合大规模提取Xanthomonas ampelinaTS206中冰核活性蛋白的实验路线。经过该实验可以得到,每10克当天得到的新鲜菌体,可以抽提所能得的冰核蛋白制品湿重约为1.2克,即得率为12%左右(。3)建立了本实验室提取Erwinia herbicola(A25)细菌全基因的实验方法;摸索确立了较适合本实验室菌种Erwiniaherbicola(A25)细菌全基因序列为模板的50μL反应体系的各组成量和最佳扩增条件。经过实验,建立了以Erwinia herbicola(A25)DNA为模板,使用KOD Dash酶作为扩增酶,获得4.2kb目的片段的方法,这在国外报道的Erwiniaherbicola group细菌冰核活性基因PCR扩增产物片段大小范围内。


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