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枯草芽胞杆菌NCD-2生物膜形成和芽胞形成相关基因的克隆及功能分析

吴园园  
【摘要】:枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株是从棉花根际土壤中分离筛选到的一株生防细菌,对由大丽轮枝菌(Verticillium dahilae Kleb)引起的棉花黄萎病具有显著的防治效果。NCD-2菌株通过抑菌、位点竞争、杀死微菌核、解磷促生长等综合作用表现出防病作用,其中,有效定殖的位点竞争作用在防治作物土传病害方面起着重要作用。因此,明确NCD-2菌株的定殖能力,解析控制和调控生物膜产生的相关基因,将有助于进一步阐明该菌株的生防机制。 本研究通过原生质转化的方法,将pHV1249质粒(携带mini-Tn10转座子)转化到枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中,构建了NCD-2菌株的突变体文库。通过在芽胞形成培养基(DSM)上比较生物膜形成能力,从4000多株突变子中筛选获得6株生物膜形成能力降低的突变子。通过Southern杂交和PCR证明转座子均以单拷贝形式插入到这6株突变子的基因组中。选取6株突变子中生物膜形成能力降低最为明显的M366菌株进行研究。通过巢式PCR技术克隆出M366菌株转座子插入位点基因的侧翼序列,基因序列比对分析表明,突变子M366中转座子插入位点的基因序列与模式菌株B. subtilis168菌株中的ywbB基因序列一致性为97%,说明突变子M366中转座子插入到ywbB基因内部。 基于NCD-2菌株全基因序列的分析表明,ywbD基因位于ywbB基因下游并且和ywbB基因由同一个操纵子调控,据此预测ywbD基因可能也参与生物膜的形成。 采用基因定位突变技术对NCD-2菌株中的ywbD基因进行缺失突变,获得缺失突变菌株NCD-2(ΔywbD)。同NCD-2菌株野生型相比,突变子NCD-2(ΔywbD)显著降低了生物膜形成能力。研究同时发现突变子NCD-2(ΔywbD)降低了芽胞的形成能力和芽胞的耐热性。采用盐酸沉淀的方法提取NCD-2菌株野生型和突变子NCD-2(ΔywbD)的脂肽类物质。平板对峙试验和离体叶片试验表明,同NCD-2菌株野生型相比,突变子NCD-2(ΔywbD)的发酵液和脂肽提取物均降低了对番茄灰霉菌的抑菌活性及对病害的防治效果。采用快速蛋白质液相色谱技术(FPLC)对NCD-2菌株野生型和突变子NCD-2(ΔywbD)的脂肽提取物进行分析,证明ywbD基因缺失突变子降低了fengycin的合成能力。胞外酶形成能力的试验表明,ywbD突变子降低了胞外蛋白酶和纤维素酶的合成能力。 本研究从枯草芽胞杆菌生物膜产生能力的角度出发,从NCD-2菌株中克隆出生物膜形成相关基因,并明确了该基因正调控NCD-2菌株生物膜的形成、芽胞的形成和耐热性能力、抑菌能力等相关性状成,为今后定向改造NCD-2菌株、提高其防病效果提供了重要理论依据。


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