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日本沼虾肝胰腺碱性磷酸酶的纯化及特性研究

张辉  
【摘要】: 从白洋淀日本沼虾肝胰腺中提取的碱性磷酸酶,经正丁醇抽提、硫酸铵分级沉 淀,0.15%NaCl溶液透析,得粗酶液。分别用Sephadex G-200葡聚糖层析柱、CM- 纤维素层析柱、DEAE-纤维素层析柱纯化粗酶,结果表明DEAE-纤维素柱层析效果 最好。 以对硝基苯磷酸二钠(PNPP)为底物,测定提纯后酶的理化性质,结果表明: 该酶的最适pH值为8.5,最适温度为45℃,Km值为2.8×10~(-3)mol/L。Mg~(2+)、Mn~(2+)、 Zn~(2+)对酶有明显的激活作用,而Cu~(2+)则表现出抑制作用。甲醛、乙醇、甲醇、Vc、 草酸、酒石酸对碱性磷酸酶均有抑制作用。 在一定条件下分别采用苯甲基磺酰氟(PMSF)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、一 氯乙酸、乙酚丙酮、巯基乙醇、甲醛等化学修饰剂选择修饰日本沼虾碱性磷酸酶的 多种氨基酸残基,并测定其酶活力变化。结果表明,巯基乙醇、甲醛、一氯乙酸能 显著抑制酶的活力,活力的下降与修饰剂的浓度相关;PMSF也能抑制酶的活力, 活力的下降与修饰时间相关;乙酰丙酮、NBS的修饰不表现对酶的抑制作用。因此 认为Lys、Ser、His残基是日本沼虾肝胰腺碱性磷酸酶的必需功能基团,部分二硫 键对保护酶的催化功能也是必需的。


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