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阿维菌素高产菌株的选育

陈川  
【摘要】: 本文首先介绍了阿维菌素的生物合成与研究概况。阿维菌素是迄今已发现最有效的杀昆虫剂、杀螨虫剂和杀寄生虫剂之一。阿维菌素为一种典型的次级代谢产物,生物合成途径复杂,现在基本上对每一步合成途径的基因及其所编码的酶都有所了解。这使得人们可利用基因工程技术来构建工程菌,增加有效组分的产出和生产新型的阿维菌素。除了用生物方法,人们还通过化学修饰来产生抗虫活性更高的阿维菌素衍生物。本论文主要为诱变筛选阿维菌素高产菌株,并对筛选到的高产菌株进行了培养条件与培养基成分的优化,为工业化生产打下基础。 本研究探讨了阿维链霉菌严重的自然分化现象,在平板分离中存在4种不同的菌落形态分化菌株,其中灰色孢子菌落占大多数,发酵效价最高;只有气生菌丝的白色菌株和只有基内菌丝的光秃型菌落占少数,还有一些灰色菌落中有白点,这些菌落发酵效价较低。这种有白点的菌落形态与灰色菌落类似,可能为放线菌中形成的异核体。白色菌株和光秃型菌株经传代培养比较稳定,灰色有白点的菌落在传代过程中不断分化出灰色、白色、光秃型菌落,直接造成遗传的不稳定性,使生产效价不稳定,为生产的大害。 在育种研究中应用了离子注入、亚硝基胍和紫外线诱变方法,并对这几种诱变方法进行了比较,发现离子注入的诱变效果最好。离子注入后阿维链霉菌的菌落形态发生了很大的变化,其中灰色,边缘整齐,中间突出有开裂的菌落和为灰色,边缘波浪状,中间突出有放射状开裂的菌株产量较高。通过两轮诱变筛选出最终得到了8株发酵效价提高并且遗传性能稳定的突变株。分别是A208、C56、B260、Z138、N10、N301、S3、E3,总效价比出发菌株提高了16.9%-63%。突变株Z138总效价最高达3900μg/ml。其中突变株N10的B_(1a)的比例提高了9.6%。 以筛选到的突变菌株Z138为实验菌株,通过摇瓶确定了发酵的工艺条件。发酵时间9-10天开始迅速合成阿维菌素;温度28℃最好;接种量12%使阿维菌素的产量较高;转速210转/分较为适合产生阿维菌素的通气量;选用30小时左右的种 MX 龄可使阿维菌素的产量提高。!t离子抑制阿维菌素的合成:在一定浓度下KZHPO4 和MgSO。对阿维菌素的合成没有影DDI(u。 培养基的优化经历了两个步骤,首先迎过单因素实验了解了培养基成分对D:I 给菌素发酵的影响,然后通过正交分析对发酵培养基进行了优化,认为玉米淀粉, 处上讲粉与玉米浆对阿维菌素的合成影响较大,并仰定了”g/1的玉米淀粉、Zg/1 玉米浆,10 g/l黄豆饼粉的发酵培养基。发酵培养基优化后使突变株 ZI3 8的阿细 菌素产量达到了4200ug/ml左右。


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