透明颤菌血红蛋白基因在苏云金杆菌的克隆与表达

【摘要】：微生物体中存在着控制和应答溶氧水平的敏感体系，该体系通过改变微生物的生长状态维持稳定的溶氧水平。已知透明颤菌在贫氧环境中能大量合成血红蛋白(VHb)以适应其在贫氧环境中生存，目前该蛋白的基因已经被克隆到多种异源生物体内，并促进了异源生物体在微氧条件下的生长和蛋白质的合成能力。本研究是将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆到苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)HBF-1和大肠杆菌中，研究该基因对苏云金杆菌和大肠杆菌生长的促进作用。 为了使vgb基因在苏云金杆菌中高效表达，本研究采用革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的穿梭质粒pMK4作为载体，果聚蔗糖酶基因(sacB)作为启动子，构建了含有果聚糖酶基因sacB启动子和vgb基因的重组质粒pMK-SV。 创造性地采用原生质体电转化的方法，将pMK-SV转入苏云金杆菌中，经影印筛选得到转化子Bt4。对Bt4诱导表达，与原菌株相比Bt4的生长量增加了20.2％。 为了将含有天然启动子的vgb基因克隆到pMK4中，本研究根据Genebank中vgb基因的编码序列设计引物，PCR扩增，得到470bp的结构基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pBV221中，构建成重组表达载体pBV-V。经温度诱导，得到了15.7kD的VHb蛋白。 合成vgb基因的天然启动子，与vgb结构基因拼接，构建重组质粒pUC-LV，通过诱导表达，重组子的菌密度增加了157％，得到了具有生理活性的15.7kD的VHb蛋白。