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利用滚环扩增和纳米粒子均相无标记检测核酸的研究

成永强  
【摘要】: 核酸及其单核苷酸多态性(SNP)的分析检测在当前生化研究和临床诊断等领域具有重要的意义。开发简便、快速、高灵敏和特异性好的均相无标记的核酸和SNP的检测新方法具有广泛的应用前景。论文主要应用滚环扩增(RCA)和纳米粒子探针技术,结合生物发光、分子荧光和共振光散射等检测技术研究开发了系列均相无标记检测核酸和SNP的新方法,主要内容如下: 1、结合简便、高效的滚环扩增反应和高灵敏的荧光虫素生物发光反应,建立了均相无标记检测SNP的新方法。方法基于突变型DNA可特异的引发滚环扩增反应,应用萤火虫素生物发光反应检测滚环扩增反应中产生的大量焦磷酸根。相对照,野生型DNA不能引发RCA反应,根据二者生物发光信号的显著差异,可实现突变型DNA的高灵敏度检测和特异地区分单碱基差别,方法对突变型DNA的定量检出限为0.45 pmol/L,可精确测定1%突变频率。 2、基于滚环扩增反应的原理,在滚环扩增反应过程中,加入与滚环扩增产物互补的反向引物,该引物以滚环扩增产物为模板引发反向顶替支化扩增,产生大量的单链和双链的DNA产物,利用特异性的DNA检测荧光染料SYBR GreenI进行荧光检测,建立了滚环扩增均相无标记荧光法检测SNP的新方法。根据突变型和野生型DNA产生的荧光信号差异,实现了1%突变频率的特异性检测和高灵敏的定量检测突变型DNA,检出限为8.6 fmol/L。 3、应用滚环扩增反应均相无标记检测微小RNA (miRNA)。方法以niRNA为模板使挂锁探针特异性的连接成环;然后以环形DNA探针为模板,miRNA直接作为引物引发滚环扩增反应,同时加入与RCA反应产物互补的反向引物,引发支化扩增,结果产生大量多种长度的单链和双链的DNA产物,应用特异性的DNA检测荧光染料进行定量。方法无需反转录步骤,操作简便、灵敏度高、可特异性地检测单碱基差别的miRNAs。 4、制备了稳定性好、便宜和生物兼容性好的氢氧化铁纳米粒子,通过静电力作用,铁纳米粒子以DNA分子为模板进行组装聚集,应用高灵敏度共振光散射技术,分析检测聚集体的共振光散射信号,建立了铁纳米粒子均相无标记定量检测DNA的新方法。方法简单、快速、灵敏度高,对E.coli基因组DNA的检出限为1.9 ng/mL。方法为进一步研究铁纳米粒子分析检测SNP、RNA或蛋白质等生物标记物提供了基础。


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