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尖孢镰刀菌拮抗细菌的筛选与抗菌蛋白的分离

王纳贤  
【摘要】: 西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的真菌性维管束系统病害,是西瓜生产中毁灭性的病害,给我国西瓜生产造成严重损失,严重制约着西瓜生产的发展。 为了得到对尖孢镰刀菌有抑制作用的菌株,本实验从西瓜根际土壤中分离到346株细菌菌株,其中菌株5-20的活性最高。经有机溶剂萃取及盐析初步确定该菌株产生的拮抗物质为蛋白类物质。通过对该菌株进行形态特征观察、生理生化试验以及16S rDNA的序列比对分析,确认该菌株为Bacillus velezensis。 对B.velezensis 5-20菌株产抗菌物质的液态发酵条件进行优化,得到了抗菌蛋白的最佳培养基组成为:玉米粉3%、蛋白胨3%、CuSO_4·7H_2O 0.05%、ZnCl2 0.05%、发酵液初始pH值为7.0、装量75 mL/250 mL、接种量10%、发酵时间36 h。优化前后蛋白抑菌活性差别明显,优化之前抑菌圈面积379.94 mm2,优化后为509.25 mm2,活性提高了34.03%。 芽孢是微生物菌剂的最佳制剂形式,对恶劣的环境因素的具有抗性,可延长制剂保存期,稳定活性。对B.velezensis5-20菌株产芽孢条件进一步进行摸索,为防治西瓜枯萎病的拮抗细菌进入工业化生产提供理论依据。产芽孢最适发酵培养基为:最佳培养基为:玉米粉0.5%、黄豆饼粉2%、MnSO4 0.3%、FeSO_4·5H_2O 0.3%;最佳培养条件为:种龄18 h、接种量10%、培养基初始pH值7.0、装量75 mL/250 mL、发酵时间48 h、温度30℃、转速220 r/min。在此优化条件下,5-20菌株发酵液中的菌体芽孢形成率大大提高,最终生物量达到2×10~9 cfu/mL,芽孢形成率达到96.75%。 用硫酸铵沉淀B.velezensis 5-20菌株发酵液中的蛋白质,透析、真空冷冻干燥后检测活性,并对其性质进行了研究。该抗菌蛋白最适作用温度为25℃,在pH6.0~8.0范围内具有较好的稳定性,最适作用pH值为7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对此蛋白有明显的激活作用。


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