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高山被孢霉脂肪酸合成主要NADPH供给基因比较研究

武迎春  
【摘要】:脂肪酸在多个领域发挥着非常重要的作用,尤其对于人体健康而言更是不可或缺。目前其主要来源有植物提取、深海鱼油和微生物提取等。植物提取由于生长周期长、造价昂贵且只能生成短链脂肪酸而逐渐被淘汰。深海鱼类更是面临着环境保护、海洋污染等一系列问题。由于高山被孢霉安全性较高、脂肪酸产量较为丰富、多产长链脂肪酸等一系列特征,逐渐成为微生物产油的目的菌株。截止到现在,国内外对高山被孢霉的研究主要集中在菌种的筛选和发酵条件的优化上,对脂肪酸合成过程中关键酶基因调控机制的研究较少。本研究通过构建编码谷氨酸脱氢酶基因GDH(Glutamate dehydrogenase)同源过表达菌株和编码谷氨酰胺合成酶基因GS(Glutamine synthetase)基因沉默菌株,对GDH在脂肪酸合成过程中的作用进行了初步探讨。同时对目前已知的NADPH(Reduced nicotinamide adenine dinucleotide)主要来源基因研究结果,结合GDH基因产还原力分析,对其进行了比较研究。主要结论如下:(1)成功构建了同源过表达菌株Mortierella alpina-GDH1、Mortierella alpina-GDH2。对其性质进行测定主要结果如下:与对照菌株相比,GDH1和GDH2的平均表达水平分别为对照菌株的9.74倍和13.67倍;GDH1过表达菌株中NADPH含量增加了28.5%、GDH2过表达菌株增加了44.6%;过表达GDH1、GDH2菌株中总脂肪酸平均含量较对照菌株分别增加了10.4%、21.5%;GDH1过表达菌株中油酸增加了28.7%,亚麻酸增加了16.7%。GDH2过表达菌株中油酸增加了29.4%,亚麻酸增加了17.0%。综合以上结果表明,过表达GDH促进了脂肪酸合成过程中所需还原力NADPH的产生,同时提高了其脂肪酸含量和不饱和度。(2)应用RNAi(RNA interference)的方法,成功构建了重组高山被孢霉Mortierella alpina-i GS。实验结果如下:与对照菌株相比,Mortierella alpina-i GS菌株中,GS基因的表达量降低了60%左右;Mortierella alpina-i GS中NADPH含量增加了35.7%;总脂肪酸含量增加了19.9%;在一定程度上提高了油酸、亚麻酸含量。综合以上实验结果表明,GS基因对高山被孢霉脂肪酸合成过程有一定的调控作用,这也与过表达GDH基因的结果相吻合。(3)本文综合多篇文献研究,对NADPH主要来源基因产NADPH及脂肪酸能力进行了比较,当NADPH主要来源基因表达量均上调50%时,不同基因过表达菌株的脂肪酸含量、NADPH含量有较大差异。其中GDH2对NADPH含量影响较大,仅次于G6PG2。从另一方面说明了GDH基因可能是被忽视的为脂肪酸合成产NADPH的另一关键限速酶之一,对脂肪酸含量具有非常重要的影响。


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