铅暴露对血脑脊液屏障维持铜稳态的影响及机制研究

【摘要】：目的本研究通过建立铅暴露大鼠模型,检测铅暴露大鼠中枢神经系统海马、皮质、脉络丛以及血液和脑脊液中铜含量变化;铅暴露对血脑脊液屏障铜清除能力的影响,进而从脉络丛铜转运蛋白(CTR1、ATP7A)及伴侣蛋白(COX17)角度初步探讨铅对中枢神经系统铜蓄积的机制。本研究结果将进一步丰富铅神经毒性的机制,同时也为铅神经毒性的标志物研究提供重要信息及相关靶点。方法45只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、300ppm铅暴露组、600ppm铅暴露组。适应性饲养7天后,通过自由饮水的染毒方式给予铅暴露组大鼠300ppm、600ppm的醋酸铅饮用水,对照组大鼠给予600ppm的醋酸钠饮用水,染毒时间为24周。每日观察记录大鼠精神状态、活动量、饮食及饮水等情况,每周检测大鼠体重变化。染毒24周结束后,应用Morris水迷宫和旷场实验检测大鼠的神经功能;应用ICP-MS检测大鼠全血、皮质、海马、脉络丛及脑脊液中铅、铜含量;利用侧脑室灌注方法检测铅暴露对大鼠血脑脊液屏障铜清除能力的影响;应用激光扫描共聚焦显微镜观察脉络丛上皮细胞铜相关蛋白(ATP7A、CTR1、COX17)表达变化及细胞中ROS水平;应用real-time PCR检测铅暴露对大鼠脉络丛atp7a、ctr1、cox17的mRNA表达变化的影响;应用试剂盒检测铅暴露对大鼠皮质氧化损伤的影响;应用透射电子显微镜观察铅暴露对大鼠脉络丛上皮细胞超微结构的损伤。结果1铅暴露24周后,与对照组比较,300ppm、600ppm铅暴露组大鼠总运动距离、总穿格数、中央区域运动距离以及中央区域停留时间均降低(P0.05);铅暴露组大鼠第3、4天的逃避潜伏期均延长(P0.05),且600ppm铅暴露组第3、4天逃避潜伏期最长(P0.05);铅暴露组大鼠穿越平台次数均下降。尤其是600ppm铅暴露组大鼠穿台次数相比对照组减少了2.93次(P0.05)。2侧脑室灌注实验结果显示:脑脊液与灌注液的Cu64比值在20min达到平台期,达到平台期后铅暴露组大鼠收集液中Cu64比值为0.769±0.026,高于对照组的0.687±0.018(P0.05);铅暴露组大鼠BCB铜清除率低于对照组(P0.05);未见铅暴露组和对照组脑脊液与灌注液的C14比值有差异(P0.05)。3与对照组比较,铅暴露组大鼠全血、海马、皮质、脉络丛、脑脊液中铅、铜含量增加(P0.05);600ppm铅暴露组大鼠全血、海马、皮质、脉络丛、脑脊液中铅含量以及全血、海马、皮质的铜含量高于300ppm铅暴露组(P0.05)。4与对照组比较,铅暴露组大鼠皮质中AGEs含量增加,抑制羟自由基能力下降,GSH-ST活性下降,GSH含量降低(P0.05)。未见铅暴露后皮质中H2O2含量发生改变。5与对照组比较,铅暴露组大鼠脉络丛上皮细胞线粒体出现肿胀现象,部分线粒体內脊熔断,细胞间紧密连接缺失,部分细胞核发生变形。6铅暴露后,脉络丛上皮细胞中CTR1、ATP7A、COX17的荧光强度均高于对照组。7铅暴露组大鼠脉络丛上皮细胞中ROS水平与对照组比较,明显增加。8与对照组比较,铅暴露组大鼠脉络丛中ctr1、atp7a、cox17 mRNA表达水平均增加(P0.05)。结论铅暴露导致中枢神经系统铜稳态失调,氧化损伤增加,这可能与铅暴露后脉络丛上皮细胞超微结构损伤,铜转运蛋白和伴侣蛋白表达改变,进而导致血脑脊液屏障对铜清除能力下降有关。