肠道菌群调控SCFAs在锰对高脂饮食小鼠神经损伤中的作用研究

【摘要】：目的锰和高脂饮食对肠道菌群的影响及其在神经损伤中的作用尚未明确。本研究通过建立锰暴露高脂饮食小鼠模型,探讨锰暴露和高脂饮食对小鼠神经行为及神经炎症的影响;阐明肠道菌群稳态对短链脂肪酸(SCFAs)及调节性T细胞(Tregs)的影响;探讨多形拟杆菌(BTeta)和丁酸梭菌(CBut)对锰暴露高脂饮食小鼠神经行为及神经炎症的改善作用。方法1选取成年雄性SPF级C57BL/6小鼠80只,随机分为对照组、高脂饮食组(HFD组)、锰暴露组(Mn组)和高脂饮食+锰暴露组(HFD+Mn组)。对照组和Mn组小鼠饲喂普通饲料,HFD组和HFD+Mn组饲喂高脂饲料;Mn组和HFD+Mn组给予10mg/kg/天Mn Cl2溶液,染毒周期12周。应用转棒试验、旷场试验和高架十字迷宫试验,检测小鼠运动协调、探究行为及焦虑状态;应用HE染色方法,观察纹状体病理损伤情况;采用Western blot技术,测定小鼠纹状体中IL-6、TNF-α、IL-10和Foxp3的蛋白表达。应用Real-time PCR技术,检测纹状体Tregs标志基因PD-1、Ctla4、Helios和Gitr,以及血脑屏障通透性相关紧密连接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin m RNA水平。2应用16S r DNA扩增子测序技术,分析实验小鼠肠道菌群结构多样性及相对丰度。同时,应用GC-MS检测小鼠粪便中SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸等)含量;采用Western blot技术测定小鼠结肠组织IL-6、TNF-α、IL-10和Foxp3的蛋白表达;利用ELISA法检测小鼠血清中IL-10和TGF-β1的蛋白水平;运用流式细胞术检测实验小鼠外周血中Treg/CD4+T细胞百分比的变化。3探讨BTeta和CBut对锰暴露高脂饮食小鼠行为和神经炎症的影响。雄性SPF级C57BL/6小鼠随机分为2组,对照组20只,给予基础饲料;其余60只给予高脂饲料+10mg/kg/天Mn Cl2溶液,染毒周期12周。随后,60只染毒小鼠随机分为高脂饮食+锰暴露组(HM组)、HM+BTeta组和HM+CBut组。干预组小鼠分别以灌胃形式给予1×108 cfu/日BTeta或CBut,持续4周。干预结束后分别检测肠道菌群多样性和相对丰度、SCFAs含量、结肠和纹状体组织IL-6、TNF-α、IL-10和Foxp3蛋白表达;纹状体PD-1、Ctla4、Helios和Gitr m RNA表达。结果1与对照组和HFD组比较,HFD+Mn组小鼠掉落潜伏期,中央区域停留时间、穿格次数、总路程和直立次数,以及开臂停留时间的百分比、进入开臂次数百分数均有显著减少(P0.05);HFD+Mn组小鼠纹状体细胞及结构出现不同程度的损伤;HFD+Mn组小鼠纹状体IL-6和TNF-α蛋白表达水平显著升高(P0.05),IL-10和Foxp3蛋白表达水平显著下降(P0.05);HFD+Mn组小鼠纹状体中Tregs特异因子PD-1、Ctla4和Helios m RNA表达水平,以及claudin-5和occludin m RNA表达水平明显低于对照组和HFD组(P(27)0.05)。以上差异均具有统计学意义。2与其它组比较,HFD+Mn组小鼠肠道菌群多样性降低;厚壁菌门/拟杆菌门的相对丰度比例升高;颤螺菌、拟杆菌、普雷沃氏菌、艾克曼菌和罗斯氏菌等相对丰度显著降低(P(27)0.05);乳杆菌相对丰度显著升高(P(27)0.05)。HFD+Mn组小鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸明显低于HFD组(P(27)0.05),结肠SCFAs特异受体基因Gpr43和Gpr109a m RNA表达水平明显低于HFD组(P(27)0.05),结肠IL-10和Foxp3蛋白表达水平显著低于其它组(P0.05),而IL-6和TNF-α蛋白表达显著高于其它组(P0.05)。此外,HFD+Mn组小鼠外周血Treg/CD4+T细胞百分比、血清IL-10和TGF-β1的蛋白表达水平显著低于HFD组(P(27)0.05)。以上差异均具有统计学意义。3 HM+BTeta组和HM+CBut组小鼠肠道菌群分类群较HM组有所增多;厚壁菌门/拟杆菌门的相对丰度比例降低,普雷沃氏菌、颤螺菌、拟杆菌和罗斯氏菌相对丰度明显回升(P(27)0.05)。与HM组比较,HM+BTeta组小鼠粪便中乙酸和丙酸含量明显升高(P(27)0.05),HM+CBut组小鼠粪便中丁酸含量明显升高(P(27)0.05),HM+BTeta组小鼠结肠Gpr43 m RNA表达水平和HM+CBut组小鼠结肠Gpr109a m RNA表达水平显著升高(P(27)0.05),HM+BTeta和HM+CBut组小鼠结肠IL-10和Foxp3蛋白表达水平显著升高(P0.05),IL-6和TNF-α蛋白表达显著下降(P0.05)。此外,与HM组比较,HM+BTeta和HM+CBut组小鼠神经行为学指标有显著变化(P0.05)。与HM组比较,HM+BTeta和HM+CBut组小鼠纹状体IL-6和TNF-α蛋白表达显著下降(P0.05),IL-10和Foxp3蛋白表达水平显著升高(P0.05)。同时,HM+BTeta组小鼠纹状体PD-1和Ctla4,HM+CBut组小鼠纹状体PD-1、Ctla4、Helios和Gitr m RNA表达水平明显高于HM组(P(27)0.05)。以上差异均具有统计学意义。结论1锰暴露加剧HFD小鼠神经损伤(神经行为异常及神经炎症),抑制Tregs功能。2锰暴露HFD小鼠存在肠道菌群及SCFAs异常。3 BTeta和CBut可能通过调节肠道菌群、SCFAs及受体,恢复机体Tregs细胞数目及功能,改善了行为异常及神经炎症,为临床利用其调节肠道菌群防治神经损伤提供了科学依据。图31幅;表20个;参301篇。