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外泌体microRNA-124在铅致肥胖群体血脑脊液屏障通透性改变中的作用研究

王希  
【摘要】:目的应用铅暴露人群、动物和细胞模型以及分子生物学手段,从外泌体microRNA调控紧密连接蛋白的角度探讨铅暴露对肥胖小鼠血脑脊液屏障通透性改变的机制,为进一步探讨铅暴露加剧肥胖群体神经损伤的机制提供理论依据。方法1应用real-time PCR验证筛选的铅暴露肥胖工人外泌体中调控紧密连接蛋白的差异microRNA,并应用Pearson相关性分析探讨人群血清外泌体miR-124与神经行为指标的相关性,多元线性回归分析探讨神经行为功能综合指数的影响因素。2铅和棕榈酸染毒脉络丛组织24h后,应用转录组测序方法对脉络丛进行转录组测序,将测序数据库和Target Scan数据库结合,筛选差异的紧密连接蛋白。3成年雄性C57BL/6小鼠40只,随机分为对照组、肥胖组、铅暴露组和肥胖+铅暴露组,采用醋酸铅饮水染毒(250 mg/L),共连续染毒12周。4应用Morris水迷宫、旷场、新物体识别实验检测小鼠染毒后的神经行为功能变化情况。5通过尾静脉注射伊文氏蓝和荧光素钠检测小鼠血脑脊液屏障的通透性。6利用脂质体转染技术构建高表达claudin11蛋白的脉络丛上皮细胞(Z310细胞)。7使用Z310细胞建立体外血脑脊液屏障模型,通过检测跨膜内皮电阻(Transendothelial electrical resistance,TEER)及辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)透过率检测体外屏障的通透性。8Western blot技术检测miR-124 inhibitor转染前后Z310细胞中claudin11蛋白的表达水平。结果1应用铅作业工人血清外泌体microRNA测序数据库中筛选出调控紧密连接蛋白的差异外泌体miR-124。验证结果显示,铅作业肥胖工人血清外泌体miR-124表达增加,且与神经行为功能综合指数呈负相关关系。2铅暴露肥胖小鼠血清外泌体miR-124的表达增加,与神经行为功能(学习记忆能力和探究行为能力)下降相关。3铅联合棕榈酸暴露脉络丛组织转录组学测序数据显示,受到miR-124调控且变化最大的紧密连接蛋白为claudin11,且肥胖+铅暴露组小鼠脉络丛中claudin11的m RNA表达显著降低,仅为对照组的31.67%,肥胖组的41.27%。4小鼠血脑脊液屏障通透性的检测结果显示,肥胖+铅暴露组小鼠脑组织中的伊文氏蓝和荧光素钠含量分别为1.17μg/m L和4.21μg/m L,显著高于肥胖组(0.66μg/m L和0.76μg/m L)和铅暴露组(0.89μg/m L和2.07μg/m L)。此外,棕榈酸+铅暴露组的跨膜电阻值显著低于棕榈酸组和铅暴露组,HRP透过率显著增加。5上调Z310细胞的claudin11后,铅和棕榈酸联合暴露组体外血脑脊液屏障的TEER增加了7.48%,HRP透过率显著降低35.48%,差异均有统计学意义。6铅联合棕榈酸暴露Z310细胞中miR-124表达增加,claudin11蛋白的表达降低。与未转染miR-124 inhibitor比较,转染miR-124inhibitor后铅和棕榈酸联合暴露组Z310细胞中claudin11蛋白的表达增加64.09%,血脑脊液屏障通透性降低。结论肥胖可促进铅暴露导致的血脑脊液屏障通透性增加,这与血清外泌体miR-124增加从而调控紧密连接蛋白claudin11表达下降相关。图23幅;表14个;参112篇。


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