不同浓度睾酮对大鼠卵母细胞和胚胎发育的影响

【摘要】：目的分析外源性睾酮浓度变化对大鼠卵母细胞和后续胚胎发育的影响,探讨优质卵母细胞及胚胎发育适宜的血清睾酮浓度,评估睾酮对体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)妊娠结局的预测作用及临床价值。方法1选择6周龄健康SD大鼠,其中雌性大鼠71只,雄性大鼠13只,适应性喂养后考察动情周期。2结合文献进行预实验,确定丙酸睾酮对大鼠作用的浓度范围及时间。3实验随机分成T_0、T_(0.25)、T_(0.5)、T_1、T_(1.5)组,连续10天通过颈背部皮下注射丙酸睾酮花生油溶液,构建不同睾酮浓度大鼠模型,对照组注射等量花生油,次日晨眼内眦取血,ELISA连续监测血清睾酮水平,每天定时称重并记录。4建立模型成功后,取出卵巢组织观察大体形态、用HE染色行卵泡形态分析及计数。5控制性促排卵后,每组各5只雌鼠收集第二次减数分裂中期(MetaphaseⅡ,MⅡ)卵母细胞,分别应用线粒体红色(Mito-Tracker Red)荧光探针、二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针、JC-1荧光探针、钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein AM)荧光探针对卵母细胞进行荧光染色,统计T_0、T_(0.25)、T_(0.5)、T_1、T_(1.5)条件下卵母细胞的荧光强度,分析卵母细胞在特定外源性睾酮浓度下的线粒体数量与分布、线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、线粒体膜电位与线粒体膜通透性。6每组另外5只雌鼠进行雌雄合笼,体内受精后,获取受精卵进行体外培养,观察后续胚胎发育。结果1不同浓度睾酮会对雌性SD大鼠体重产生差异化的作用,其中T_(0.25)组大鼠体重较高,而T_(1.5)组大鼠体重较低,差异具有统计学意义,P0.05。2雌性SD大鼠内环境最终使睾酮水平维持在一个范围波动,观察期前7天内各组大鼠血清睾酮浓度皆高于T_0组,差异具有统计学意义,P0.05,并随时间呈现下降趋势,各组间睾酮浓度不同,差异具有统计学意义,P0.05,观察期末3天各组SD大鼠血清睾酮浓度趋于稳态,各组间差异与外源性睾酮浓度正相关,整体比T_0组高,差异具有统计学意义,P0.05。3与T_0组相比,T_(0.25)组大鼠生长发育的卵泡数量增多,T_(1.5)组囊状卵泡与闭锁卵泡的数量上升,差异均具有统计学意义,P0.05。4 Mito-Tracker Red荧光探针标记线粒体数目与分布染色结果显示,相对于T_0组,T_(0.25)组荧光强度变强,差异具有统计学意义,P0.05,T_(0.5)、T_1、T_(1.5)组的荧光强度相对T_0组降低,差异亦具有统计学意义,P0.05。5 DCFH-DA荧光探针标记卵母细胞活性氧的结果显示,与T_0组相比,T_(0.25)组的卵母细胞荧光强度较高,ROS浓度较大,而T_(0.5)、T_1、T_(1.5)各组卵母细胞荧光强度降低,ROS浓度逐渐减小,差异具有统计学意义,P0.05。6 JC-1荧光探针标记卵母细胞线粒体膜电位的结果显示,相对于T_0组,T_(0.25)组卵母细胞线粒体膜电位提高,膜电位荧光强度特征值增加,T_(0.5)、T_1组卵母细胞线粒体膜电位降低,膜电位荧光强度特征值减少,差异均具有统计学意义,P0.05。7 Calcein AM荧光探针标记线粒体膜通透性的结果显示,T_(0.25)组卵母细胞荧光强度相对于T_0组增加,T_1组卵母细胞荧光强度相对于T_0组降低,差异具有统计学意义,P0.05。8外源性睾酮浓度对SD大鼠胚胎发育具有显著影响,其中T_(0.25)组,胚胎发育正常,优胚率较高,而T_1组,胚胎发育相对质量较差,优胚率较低,差异具有统计学意义,P0.05。结论1给大鼠注射适中浓度的外源性睾酮(约0.25mg/m L)可以促进卵巢、卵母细胞及其线粒体的活性,维持胚胎的健康发育;2注射过高浓度的外源性睾酮(1mg/ml)会对雌鼠的卵巢、卵母细胞线粒体、胚胎后续发育造成负面影响;3给大鼠注射0.5mg/m L的中等浓度外源性睾酮,对大鼠的相关性状影响不大;4基于大鼠中实验结果,提示在临床体外受精-胚胎移植技术中,维持适中的睾酮浓度用以改善不孕患者的卵母细胞及胚胎发育状况,可能是一种较有效的治疗手段。图16幅;表5个;参147篇。