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玉米大斑病菌cAMP磷酸二酯酶基因调控病菌发育的功能研究

申珅  
【摘要】:大斑刚毛球腔菌(Setosphaeria turcica (Luttrell)Leonard﹠Suggs,俗称玉米大斑病菌)属子囊菌门毛座腔菌属,由其引起的玉米大斑病是一种严重威胁玉米生产的真菌病害,多发生于全球冷凉地域的玉米产区,常造成严重经济损失。研究表明,cAMP信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号跨膜转导途径,对植物病原真菌的形态发生及发育、次生代谢以及致病性等生物进程均起着非常重要的调控作用。本试验利用简并引物PCR法克隆了2个玉米大斑病菌cAMP磷酸二酯酶基因,其中包括1个高亲和力cAMP磷酸二酯酶基因(StH-PDE)和1个低亲和力cAMP磷酸二酯酶基因(StL-PDE)。分别创制StH-PDE和StL-PDE基因敲除突变体,对目的基因进行功能研究,主要研究结果如下: 1.从玉米大斑病菌基因组中,获得了1个高亲和力cAMP磷酸二酯酶基因和1个低亲和力cAMP磷酸二酯酶基因,分别命名为StH-PDE和StL-PDE。其中,StH-PDE基因DNA全长3208bp,含有6个外显子和5个内含子,cDNA为2898bp,编码965个氨基酸,编码产物计算分子量约为107.16kD;StL-PDE基因DNA全长5054bp,含有5个外显子,4个内含子,cDNA为3089bp,编码1019个氨基酸。上述基因的内含子基本符合GT-AG法则。 2. StH-PDE编码产物的氨基酸序列与多种病原真菌,如Aspergillus fumigatus、Botrytis cinerea、Metarhizium acridum、Neosartorya fischeri等的H-PDE氨基酸序列相似性在33.12%~36.60%之间,具有保守的Ⅰ型cAMP磷酸二酯酶催化结构域、Ⅰ型cAMP磷酸二酯酶保守位点和依赖金属离子的磷酸水解酶保守“HD”基序(HD motif),但与StL-PDE的相似性仅为20.33%,说明两个基因属于不同的磷酸二酯酶类群。StL-PDE编码产物的氨基酸序列与Trichoderma reesei、 Beauveria bassiana、Colletotrichum higginsianum、Talaromyced stipitatus等病原真菌的L-PDE氨基酸序列相似性为21.98%~23.06%,其中含有L-PDE特有的Ⅱ型cAMP磷酸二酯酶催化结构域。 3.检测了StH-PDE基因在玉米大斑病菌不同发育时期的表达规律,发现StH-PDE基因在菌丝时期的表达量最高,在孢子萌发时期以及附着胞形成时期次之,在分生孢子发育以及侵染丝形成时期表达量最低。 4.利用质粒pUCATPH和pBS,根据基因同源重组原理,构建了StH-PDE基因敲除载体。将重组DNA片段通过PEG介导转化玉米大斑病菌原生质体,经潮霉素筛选获得了潮霉素抗性转化子,通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物及StH-PDE基因特异性引物对转化子进行PCR筛选,得到了9株阳性转化子;对其中3株转化子进行单孢分离,并进行Southern blot及RT-PCR验证,最终获得2株StH-PDE基因缺失突变体菌株△StH-PDE2和△StH-PDE3。对△StH-PDE2和△StH-PDE3突变体进行了功能分析,发现2株突变体菌落颜色呈深黄色,气生菌丝减少,且生长速度较野生型菌株慢;菌丝细胞膨大,细胞分隔变短且表面出现不规则褶皱,细胞壁完整性降低,菌丝细胞外包裹红色分泌物;其次,突变体菌株具产孢缺陷,菌丝可在玻璃纸表面诱导形成附着胞,但附着胞形成过程明显延迟,且穿透玻璃纸的能力降低;再者,突变体菌株细胞内甘油含量升高,抗盐胁迫能力增强,疏水性下降,易出现可湿表型,胞内黑色素含量降低;漆酶及HT-毒素活性没有明显变化;此外,经组织病理学观察发现,突变体菌株能够正常侵入寄主组织,但侵染效能较野生型有所降低。RT-PCR分析表明,StH-PDE基因对细胞壁合成相关基因(CHS、GFA、FKS、GSC、GEL)、微管蛋白基因Tubulin、疏水性调控基因MPG1、水甘油通道蛋白基因FPS以及调控黑色素合成的转录因子基因SMR的表达均有重要的调控作用。 6.检测了StL-PDE在玉米大斑病菌不同发育时期的表达规律,结果表明,StL-PDE基因在玉米大斑病菌菌丝时期的表达量最高,其次是在孢子萌发时期和附着胞形成时期。 7.利用相同的基因敲除载体构建策略构建了StL-PDE基因敲除载体,经潮霉素抗性和PCR筛选获得了10个转化子。对其中的△StL-PDE1和△StL-PDE10突变菌株单孢分离,并经Southern blot及RT-PCR验证,明确其为StL-PDE缺失突变体。对△StL-PDE1和△StL-PDE10突变体菌株进行了表型分析,发现突变体气生菌丝较野生型茂密,且生长速度较野生型菌株略快;突变体菌丝出现多分枝现象,分生孢子产量降低,且细胞分隔处表面出现不规则突起,菌丝可在玻璃纸表面诱导产生附着胞,但其穿透玻璃纸的能力较野生型降低;其次,突变菌株细胞内甘油含量积累升高,抗盐胁迫能力增强;胞内黑色素含量减少;漆酶活性显著降低。RT-PCR分析表明,△StL-PDE1、△StL-PDE10突变体中细胞壁合成相关基因(CHS、GFA、FKS、GSC、GEL)、微管蛋白基因Tubulin、疏水性调控基因MPG1和野生型菌株没有明显差异;水甘油通道蛋白FPS表达量略有下调。 由此得出结论:1)StH-PDE基因在调控玉米大斑病菌菌丝细胞形态建成以及细胞完整性、分生孢子发育、次生代谢、感知营养的能力、胞内黑色素生物合成、应答盐胁迫反应以及致病性等方面均具有重要调控作用;2)StL-PDE在调控玉米大斑病菌分生孢子发育、菌丝附着胞的侵染能力以及胞内漆酶活性等方面具有重要调控作用。3)StH-PDE基因在玉米大斑病菌生长发育过程中担负主要的调控作用,而StL-PDE基因则担负较为次要的调控作用。


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