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《河北农业大学》 2015年
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苹果褪绿叶斑病毒与苏俄苹果互作寄主因子的鉴定及亚细胞定位

何乙坤  
【摘要】:苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是苹果上危害最大的一类潜隐性病毒,广泛分布于世界各地。该病毒单独侵染或与其它病毒混合侵染严重影响果树产量及果实品质,造成严重的经济损失。本研究在利用酵母双杂交技术筛选能与ACLSV CP、MP互作的苏俄苹果寄主因子的基础上,通过生物信息学分析,从中选取可能具有重要功能的寄主因子。利用酵母双杂交、Pull-down技术进行进一步互作验证。然后,对ACLSV功能基因CP、MP及互作寄主基因Malus15-1进行了亚细胞定位。本研究结果将为揭示寄主基因在ACLSV侵染过程中具有的生物学功能及两蛋白互作的意义奠定基础。主要研究结果如下:1.利用酵母双杂交技术验证了苏俄苹果寄主因子Malus15-1、Malus40-5与ACLSV CP、MP的互作。首先,构建带有完整寄主基因Malus4-1、Malus15-1、Malus40-5、Malus72-3、Malus 85-1、Malus86-1的酵母双杂交表达载体。然后,利用共转化法将诱饵载体p GBKT7-CP、p GBKT7-MP与带有上述6种寄主基因的酵母表达载体转化至酵母菌株Y2H gold中,将共转化产物涂布于四缺(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal)培养基上,观察酵母的生长及显色情况,验证寄主功能基因与寄主基因之间的互作。结果表明寄主因子Malus15-1、Malus40-5在四缺平板上菌落呈明显蓝色,证明CP、MP与寄主因子Malus15-1、Malus40-5互作。2.利用Pull-down技术验证了ACLSV CP、MP与寄主因子Malus15-1之间的相互作用。首先,构建原核表达载体p ET28a-CP、p ET28a-MP、p ET28a-15-1和p ET28a-40-5,然后将重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,并诱导表达目的蛋白。采用Pull-down方法,将洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot检测蛋白间的互作。结果表明,以CP为诱饵捕获Malus15-1蛋白,洗脱产物中有21.5 k Da、16 k Da两条明显条带;以MP蛋白为诱饵捕获Malus15-1蛋白,洗脱产物中有50.8 k Da、16 k Da两条条带,证明CP、MP与Malus15-1之间存在直接相互作用。同样分别以CP、MP为诱饵捕获Malus40-5蛋白,洗脱产物中仅有一条条带,证明CP、MP与Malus40-5蛋白之间无相互作用。3.揭示了ACLSV MP、CP及Malus15-1在本氏烟细胞中的定位情况。构建瞬时表达载体p Cam35s-gfp-CP、p Cam35s-gfp-MP及p Cam35s-gfp-15,利用液氮冻融法将重组载体转入农杆菌EHA105菌株,在供试本氏烟叶片下表皮注射农杆菌,利用激光共聚焦显微镜观测目的基因与GFP融合蛋白在本氏烟细胞中的定位情况:CP可能定位在细胞核和细胞质中,MP可能定位于细胞质和(或)内质网上,Malus15-1可能定位于细胞质中。
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