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玉米大斑病菌黑色素合成调控基因StMR1转录活性及调控机制分析

孟庆江  
【摘要】:玉米大斑病(Northern Leaf Blight of Corn)是玉米生产中重要的叶部病害,常造成严重经济损失,直接影响玉米安全生产。引起玉米大斑病的病原真菌为大斑刚毛座腔菌Setosphaeria turcica(Luttrell)LeonardSuggs,黑色素是其重要的致病因子之一,本实验室前期分离鉴定了一个对黑色素生物合成途径具有调控作用的转录因子St MR1,本研究通过酵母自激活试验对其转录激活活性及对酵母细胞毒性进行分析;通过构建GFP标记的过表达载体进行亚细胞定位;利用染色质免疫共沉淀方法,分析其调控黑色素合成酶基因的分子机制。主要结果如下:1.构建了St MR1基因诱饵表达载体,转录激活活性分析表明其具有较高的转录激活活性,且对酵母细胞无毒性;2.以GFP标记的p BARKS1质粒为载体构建了St MR1基因过表达载体,并通过PEG介导的方法转化玉米大斑病菌菌株01-23,得到过表达菌株;3.荧光观察,St MR1基因定位于细胞核中,符合St MR1基因为转录因子通过作用于靶基因启动子区而调控靶基因表达的特性;4.对病菌染色质免疫共沉淀的试验条件进行了探索,发现当甲醛浓度为1%时交联30 min使用180W 5 s超声/10 s间歇、工作2~3 min可使染色质片段断裂至200~1000 bp,适合进行下游试验;5.利用NNPP等启动子分析网站对黑色素合成酶基因上游约2000 bp碱基序列进行启动子及顺式作用元件位点分析,获得了各基因预测启动子位点及蛋白结合位点;6.利用染色质免疫共沉淀技术分析St MR1基因对黑色素合成过程中6个合成酶基因的调控作用,明确了St MR1基因通过直接调控黑色素合成酶基因St3HNR、St4HNR、St LAC2、St PKS的表达调节玉米大斑病菌黑色素的生物合成。


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