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苹果褪绿叶斑病毒互作寄主因子的筛选

段豪  
【摘要】:苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是苹果生产上为害最大的潜隐性病毒之一,广泛分布于世界各地,该病毒单独侵染或与其它病毒混合侵染可致使树势衰弱,发生慢性病害,严重影响果树的生长和产量。近年来,国内外学者对ACLSV生物学特性进行了较为广泛的研究,但多从病毒本身出发,基本明确了该病毒的危害症状、血清学特性和分子变异等特征,病毒所编码蛋白的功能作用、病毒的致病机制及病原与寄主互作机制等还不是很明确,与病毒互作寄主因子的研究存在欠缺。因此,本研究在构建苏俄苹果(Malus sylvestris cv. R12740-7A)cDNA文库的基础上,利用酵母双杂交系统筛选与ACLSV互作的苏俄苹果寄主因子,并对其功能进行分析,从而为揭示病毒的致病机制、病毒对寄主生长发育的调控情况和寄主对病毒的抗感应答反应奠定基础,为果树抗病毒种质资源的开发提供理论依据。获得的主要结果如下: 1、以苏俄苹果(Malus sylvestris cv. R12740-7A)组培苗为材料,构建了以真核表达载体pGADT7为基础的苏俄苹果酵母双杂交cDNA文库。通过异硫氰酸胍法提取了组培苗的总RNA,分离纯化得到了mRNA,通过SMART法合成dscDNA,dscDNA经酶切与pGADT7文库质粒载体连接,电转大肠杆菌DH10B,经涂板检测,初始文库滴度为2.67×105cfu/mL,库容量为4.0×106cfu,随后将文库进行了百万扩增,扩增后文库滴度为1.0×108cfu/mL,库容为1.5×1010cfu,在文库中随机挑取46个克隆,PCR鉴定插入片段,1kb以上的片段测得大于75%,且重组率为100%,说明文库质量较高,符合文库构建标准,为后续实验的展开奠定了基础。 2、以pGBKT7载体为基础,构建了ACLSV外壳蛋白(coat protein, CP)和运动蛋白(movement protein, MP)酵母双杂交诱饵载体。通过RT-PCR获得ACLSV CP、MP功能蛋白完整基因序列,通过酶切连接构建到pGBKT7载体上,获得重组子pGBKT7-CP和pGBKT7-MP,测序验证序列准确性,转化到酵母菌Y2H gold中,进行毒性试验和自激活活性检测,证明了诱饵载体无毒性及自激活活性,可作为后续酵母双杂交诱饵载体。 3、以ACLSV CP和MP为诱饵蛋白,从苏俄苹果cDNA文库中筛选到79个互作靶基因,通过生物信息学分析,其中13个在与病毒互作过程中起重要作用。采用PEG/LiAc法顺序转化质粒,将诱饵质粒pGBKT7-CP和pGBKT7-MP分别转化到酵母菌Y2H Gold中,再将苏俄苹果cDNA文库质粒分别转化到含有诱饵质粒的酵母菌中,转化产物涂布于二缺、三缺和四缺营养缺陷型培养基上,挑取四缺培养基上的阳性克隆,提取酵母质粒,用pGADT7通用引物进行PCR鉴定,选取cDNA插入片段大于500bp的阳性克隆转化到大肠杆菌,涂布LB(100μg/mL Amp)平板,挑取阳性克隆,再次进行菌落PCR鉴定,鉴定结果一致的克隆进行测序。初步钓取到79个能与病毒互作的靶基因,通过生物信息学分析,明确了靶基因片段的大小、读码框完整性、读码框一致性,根据GenBank中同源序列的注释信息分析获得13个可能与病毒互作的靶基因,初步预测了靶基因与病毒互作的意义。


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