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HPLC指纹图谱技术检测食品中金黄色葡萄球菌的研究

赵元煜  
【摘要】:金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus SA)是世界上公认的一种重要的食源性病原菌。其广泛存在于在自然界中,它可在污染的食品中生长繁殖,可产生肠毒素,引起食物中毒。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌主要采用传统的分离、培养、生化鉴定的方法,其操作繁琐,检测周期长,已经不能满足食品中致病菌快速检测的需要,急需建立新的致病菌快速检测方法。 本研究以金黄色葡萄球菌标准菌株和筛选菌株中为研究对象,建立金黄色葡萄球菌指纹图谱,并利用该菌指纹图谱检测食品中金黄色葡萄球菌的污染情况。采用高效液相色谱法对34株金黄色葡萄球菌和20株非金黄色葡萄球菌建立菌体细胞萃取物色谱图,通过比较确定了金黄色葡萄球菌的特征峰。以金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为内标物(特征峰),将特征峰与标准峰的相对保留时间作为数据基础建立金黄色葡萄球菌指纹图谱,将两类指纹图谱的相关系数分布进行分析比较确定限值,构建出指纹图谱的计算方法,从而用于菌种鉴定。在指纹图谱构建过程中,分别对金黄色葡萄球菌菌体细胞萃取物的累积、提取以及其液相色谱条件进行优化,并对金黄色葡萄球菌鉴定方法进行了评价和应用。优化确定菌体细胞萃取物的提取条件为:营养肉汤培养基中接数量级为103cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液,摇床培养12h,以离心力6654g离心6min去上清,用灭菌水洗涤两次,加入10mL甲醇制成菌悬液于超声波细胞破碎仪超声破碎10min,再以离心力6654g离心6min取上清,旋转蒸发至1~2mL,过有机滤膜。以上条件可以保证金黄色葡萄球菌菌体细胞萃取物可被检测到至少15个完全分离的共有峰。通过HPLC条件的摸索建立了金黄色葡萄球菌指纹图谱,其色谱条件为:氨基柱XB-NH (4.6mm×25mm,5μm);流动相A:0.05%甲酸水溶液;流动相B:乙腈。梯度程序(min/B%)为:0-15min为90%-80%;15-20min为80%-65%;20-35min为65%-5%;35-40min为5%-0%。紫外检测器的检测波长为:280nm;流速为:0.8mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。该方法从菌株胞内物质提取到报告结果,耗时2h。从增菌培养到鉴定结果报告的得出也只需要14h。通过混菌鉴定和双盲实验对该方法识别金葡菌进行可行性及准确性验证。实验证明,利用金黄色葡萄球菌指纹图谱方法可以从混菌培养物中检测到金黄色葡萄球菌。双盲实验结果与初始污染记录一致,进一步验证了利用该方法快速鉴定金黄色葡萄球菌的正确性及其可行性。 研究表明,HPLC方法在对金黄色葡萄球菌的识别具有一定的可行性、该方法操作简单、耗时短、特异性好,为快速检测金黄色葡萄球菌构建了一个新的技术平台,同时为微生物的检测开拓全新的鉴定方法。


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