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解磷解钾特异菌株CX-7的筛选及其应用试验研究

张爱民  
【摘要】:该研究从8个省份的不同类型土壤分离到297株芽孢杆菌,从中筛选到一株解磷、解钾特异菌株,对其解磷解钾效应、抑菌物质的分离、发酵条件及其试验应用效果进行了评价,主要研究成果如下: 一、多功效芽孢杆菌的分离和筛选 从全国8个省份分离到297株芽孢杆菌,其中89株具有解磷解钾活性,从中筛选解磷解钾强度高的菌株。 1、解磷解钾活性定量分析 通过液体摇瓶解磷解钾试验,测定89株菌株培养液中水溶性磷和水溶性钾的含量,以胶冻样类芽孢杆菌K-7(ACCC10013)为参比菌株,遴选出解磷解钾活性较高的BY-3、BY-4、CX-7、CX-14、NX-42、NX-43和SS-12菌株,其中CX-7菌株对磷酸三钙和钾长石的分解能力分别为K-7菌株的1.84和2.53倍。 2、病原微生物拮抗试验 采用平板对峙法测定BY-3、BY-4、CX-7、CX-14、NX-42、NX-43和SS-12菌株及其培养液对小麦、棉花等病原微生物的拮抗作用试验,证实各菌株均具有拮抗的功效,其中CX-7菌株抗菌谱较广,对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦根腐病菌(Fusarium culmorum)和棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)均有抑菌活性,抑菌圈直径分别为17.3mm、18.3mm、16.7mm、20.1mm和16.9mm。 3、盆栽试验 通过玉米盆栽,研究了BY-3、BY-4、CX-7、CX-14、NX-42、NX-43和SS-12菌株对玉米的促生长作用,结果表明接种CX-7菌株的玉米株高较对照增加7.8%,叶面积增加18.0%,采用3414统计软件进行生物统计,均达到极显著性差异水平,与其他菌株比较达显著性差异水平。 二、CX-7菌株的鉴定及代谢产物分析 1、CX-7菌株的鉴定 通过对CX-7菌株进行菌体、芽孢形态和菌落形态观察,进行相关生理生化反应测定,并结合16S rDNA序列测定、同源性比和建立系统发育树,依据伯杰氏细菌学鉴定手册,鉴定CX-7菌株为克里不所类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)。 2、CX-7菌株的代谢产物分析 通过高效液相色谱仪测定CX-7菌株发酵液含有四种有机酸含量分别为4.57mg/L,12.63mg/L,10.48mg/L和10.12mg/L;采用乙醇沉淀测定其培养液中多糖含量达到8.5mg/L。 通过硫酸铵沉淀法得到CX-7菌株的抗菌蛋白类物质,该蛋白对棉花枯萎病病原微生物具有拮抗作用,该蛋白最适作用pH值7.0,温度25℃,Mg2+和Mn2+具有激活作用,Cu2+、Zn2+和Na+具有抑制作用。经DEAE-Sephadex离子交换树脂分离纯化,并经SDS-PAGE检测该蛋白的分子量约为50KDa, 三、CX-7菌株发酵条件研究 1、最佳产芽孢条件研究 采用单因子和正交试验方法,通过测定培养液中芽孢形成率,确定了CX-7菌株的最佳培养基配比为淀粉5%,豆饼粉1.5%,MgSO40.07%,NaCl0.05%;最佳培养条件为摇瓶种子种龄20h,接种量4%,培养基初始pH8.0,装量100mL/250mL。 2、20m3发酵试验 利用20m3发酵罐进行CX-7菌株发酵试验,经多次试验证实,采用克氏瓶种子接种发酵周期在36h左右,芽孢生物量达到8.9×108cfu/mL;最佳通风比1:0.8-1.0,接种量8%,培养温度32-34℃。 3、CX-7菌株发酵液后处理工艺研究 CX-7菌株发酵液离心浓缩工艺为,流量0.5T/h,浓缩倍率8倍,收率95%。采用旋转闪蒸干燥器进行干燥,工艺参数为入口温度135℃、出口温度50-60℃,进料速率80kg/h,在此条件下得到CX-7菌株菌粉,含菌量为2.89×1010cfu/g,含水量≤5%。 四、CX-7菌株应用效果研究 1、CX-7菌株对土壤酶活性及磷钾养分的影响 通过玉米盆栽试验,测定了不同生长期根际土土壤酶活力、速效磷及速效钾含量。结果证实玉米接种CX-7芽孢杆菌,到五叶期土壤各种酶活性均高于对照,其中蔗糖酶活性增加5.27mg/g·24h(四叶期);过氧化氢酶活性增加0.47(0.1moL/LK2MnO4)mL/g;磷酸酶活性增加0.29PhOH mg/g;脲酶活性增加0.18NH3-N mg/g;速效钾含量提高20.0%;速效磷含量提高57.4%。因此接种该菌株可改善玉米根际土壤的生态环境。 2、CX-7菌株制剂的大田应用试验 采用简单对比试验进行烟草接种试验,结果表明,亩基施CX-7菌株制剂(50亿/克)0.5kg,能促进烟株生长发育,提高烟叶产量、上等烟叶率和中上等烟叶率,提高烟叶等级,同时底施该肥料制剂,可减少一半的基肥施用,增加烟农的收益。 采用拌种方法进行小麦小区试验,亩施用CX-7菌株制剂(50亿/克)0.1kg,可促进小麦的生长发育,提高小麦产量。


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