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大白菜EMS突变体叶色深绿及抗软腐病基因功能分析

刘梦洋  
【摘要】:大白菜(Brassica rapa.ssp.pekinesis)原产于中国,属十字花科芸薹属(Brassica),是我国种植面积最广的蔬菜作物。EMS作为诱变剂获得突变体,具有突变频率高、易于筛选、产生可稳定遗传点突变等多重优点,是突变体创制应用最广泛的方法。本研究以EMS构建的大白菜突变体库中筛选出一株叶色深绿突变体dg为试材,研究突变体dg生理特性,对突变基因的遗传特性进行分析,并利用MutMap技术定位突变位点。通过转基因技术将突变基因过表达到野生型WT中,观察转基因植株表型。借助转录组测序(RNA-Seq)技术,结合RT-qRCR验证,旨在全面揭示突变基因表达调控机制。并分析野生型WT及突变体dg叶绿体中蛋白翻译水平表达量,检测野生型WT和突变体dg类囊体膜蛋白及原核表达蛋白的催化效率。旨在完善突变基因转录水平和翻译水平表达调控机制,明确突变基因功能,提出突变基因影响叶色的假设机制。本研究通过建立适宜的软腐病接种筛选的方法,并根据EMS突变体库的抗性特点建立软腐病抗性的分级评价体系,以期在EMS构建的大白菜突变体库中准确地筛选出的抗软腐病突变体。以EMS构建的大白菜突变体库中筛选出一株抗软腐病突变体sr为材料,利用RNA-Seq技术,探究了大白菜防御软腐病抗性表达调控机制,并检测侵染前后大白菜重要次生代谢产物及内源激素的变化,旨在多角度阐释大白菜防御软腐病作用机理。主要研究结果如下:1.深绿色突变体dg在生殖生长期和营养生长期叶色皆为深绿色,其生长速率高于野生型,叶绿素a和b含量都极显著增加,而叶绿素a/b比值降低,光合特性研究表明,突变体dg捕光能力增强,在弱光下光吸收能力增强,光合速率高于野生型,但蒸腾速率差异不大。叶绿素荧光参数结果揭示,叶色深绿突变体dg虽然光能最大转化效率有所损失,但光合机构实际光能转换效率高于野生型WT。2.叶色深绿突变体dg突变基因受一对隐性基因控制。利用Mutmap测序定位的突变位点位于突变基因BrFC2 CDS的1391bp处,该位点由G突变成A,相对应的在第465个氨基酸,由精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)。克隆FC2基因测序结果与KASP初步验证了该位点为候选突变位点。3.过表达突变基因BrFC2-dg到野生型WT中,表型改变显著,转基因株系叶片显示深绿色,与突变体dg表型性状一致。但将过表达野生基因BrFC2-WT到野生型WT中,表型未有改变。进一步验证BrFC2中突变位点即为突变体dg表型突变为深绿色的主要原因。4.深绿色突变体dg血红素与野生型相比含量极显著增加。在叶绿素合成过程中,五个重要物质ALA、PBG、ProtoIX、Mg-ProtoIX和Chlide在突变体dg中含量增加,其增加可能与叶绿素含量上升密切相关。转录组分析表明,BrFC2表达量在野生型WT与突变体dg中几乎不变。在叶绿素及血红素合成途径中共有9个基因上调,1个基因下调。同时叶色深绿突变影响光合作用系统I和II中多个光氧化相关、光系统亚基和捕光蛋白复合物表达量下调。5.蛋白BrFC2在野生型及突变体中蛋白含量差异不显著。在卟啉和叶绿素代谢途径中两个蛋白差异下调;光合作用-天线蛋白途径中4个蛋白含量上调。FC2蛋白保守motifs分析结果显示,叶色深绿突变位点就发生在C端有一段有50个氨基酸组成的相当保守的motif。BrFC2-WT和BrFC2-dg基因编码氨基酸序列的二级结构分析结果表明,BrFC2-dg较BrFC2-WT二级结构多一个构成无规则卷曲的氨基酸,少一个构成延伸链的氨基酸。6.融合蛋白亚细胞定位结果显示,BrFC2-dg-GFP融合蛋白定位于在叶绿体中。野生型WT和突变体dg类囊体膜蛋白(含FC2)及原核表达BrFC2-WT和BrFC2-dg蛋白的催化效率结果显示,无论突变体dg类囊体膜蛋白(含FC2)还是原核表达BrFC2-dg蛋白催化效率都极显著高于野生型。7.通过离体和活体两种鉴定方法,从大白菜800株EMS突变体库中筛选出一株抗软腐病突变体sr,野生型WT活体及离体病情鉴定级别均为9级,为软腐病易感型;抗软腐病突变体sr活体及离体病情鉴定级别均为1级,为抗软腐病突变体。8.利用RNA-Seq技术,在接种后0、6、12和24小时内,我们调查了抗软腐病突变体sr和野生型WT对Pcc的调控反应。抗软腐病突变体和野生型同时侵染12h后,差异基因数目为512个(上调基因421个、下调基因91个)。初步明确了接种6-12h可能是大白菜对软腐病菌防卫的重要调控期。PTI在植物对Pcc的防御中扮演着核心防御角色,由M/PAMPs或DAMPs通过细胞膜表面的PRRs触发的,进而引起一系列的免疫反应。Pcc可刺激寄主植物增加內源激素茉莉酸的含量,JAs的积累参与了大白菜对Pcc的免疫反应,JA/ET作为正向调节信号可以增强对Pcc的抗性。SA介导的激素信号传导通路参与对Pcc防御反应可能是通过抑制IAA信号参与激活对Pcc的防御反应。外源性生长素、MEJA和BTH的喷施也证实其在免疫系统中起作用。9.吲哚族和芳香族硫甙在大白菜抗软腐病突变体sr中积累并发挥了防御Pcc的功能。在大白菜受到Pcc侵染后,硫甙和木质素合成基因表达上调,硫甙和木质素含量提高可增加对病原菌的抗性。


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