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玉米大斑病菌StHog1对转录因子StMsn2的调控作用及StMsn2下游靶基因的筛选与验证

吕润玲  
【摘要】:本课题组在前期研究中利用农杆菌介导的转化技术获得了玉米大斑病菌StHOG1基因的敲除突变体(ΔStHOG1)。通过分析ΔStHOG1菌株,发现StHOG1基因参与调控病菌的高渗胁迫反应,并推测StMsn2可能为StHog1下游的一个关键转录因子,其活性受StHog1磷酸化调节,但其具体的分子机制尚不清楚。本研究拟在前期研究基础上以ΔStHOG1菌株为材料,分析StMSN2在转录及其蛋白表达水平来明确StHog1对StMsn2的调控;利用染色体免疫共沉淀(ChIP)、电泳迁移率变动分析(EMSA)及双荧光报告系统筛选并验证转录因子StMsn2下游所调控靶的基因。因此,本研究不仅明确转录因子StMsn2与StHog1的调控关系及StMsn2下游所调控靶的基因,也对进一步完善HOG-MAPK信号通路对调节玉米大斑病菌高渗胁迫反应的分子机制具有重要意义。主要结果如下:1.StMSN2的cDNA序列包含一个长度为1617 bp的开放阅读框(ORF)及编码的蛋白具有两个保守锌指结构域(ZnF-C2H2),分别位于N末端氨基酸的第418~441和447~469位;系统发生分析表明StMsn2与Aspergillus parasiticus中Msn2亲缘关系较近。2.利用抗原表位的方法制备了3个StMsn2的多克隆抗体(Msn2-1,Msn2-2和Msn2-3),并通过Western blot技术检测抗体的特异性,发现Msn2-2抗体特异性较强。3.利用RT-qPCR和Western blot技术对ΔStHOG1菌株进行分析,发现突变体中StMSN2基因转录水平极低并且其编码的蛋白不表达,说明在玉米大斑病菌中StHog1位于StMsn2上游并调控其表达。4.利用Western blot技术验证在高渗条件下(0.4 M NaCl)StMsn2蛋白的表达水平变化,结果检测到两条清晰地条带,其质量分数相差约10 kDa;进一步利用去磷酸化酶对蛋白进行处理,发现上述质量分数较大的条带变窄,较小条带变宽,证明StMsn2蛋白发生了磷酸化修饰并参与病菌的高渗胁迫反应。5.利用ChIP-Seq技术在玉米大斑病菌中筛选出9个StMsn2调控的候选靶基因;生物信息学分析表明,这9个基因的启动子区均存在StMsn2结合的Motif序列;进一步利用ChIP-qPCR技术,验证StMsn2转录因子可以与StATA1和StODA1基因的启动子区结合,表明基因StATA1和StODA1为StMsn2所调控的下游靶基因。6.在原核系统中表达并纯化StMsn2-His重组蛋白,并利用EMSA技术证明了StMsn2能够与基因StATA1和StODA1启动子区的STRE元件(5’-CCCCT-3’)直接结合;进一步在烟草系统中进行转录激活实验,表明StMsn2转录因子能够与基因StATA1和StODA1启动子区的STRE元件结合并激活报告基因的表达。


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