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河北部分区域奶牛乳房炎主要致病菌鉴定及多重PCR检测方法的建立

夏颖  
【摘要】:奶牛乳房炎是奶牛养殖过程中的常见疾病之一,并且在有奶牛饲养的地区均有此病的发生。该病的发生与饲养管理和环境因素密切相关,一旦发病,难以控制其传播或从根本上消除。本研究根据河北DHI数据监测奶牛体细胞水平,对邯郸、衡水、石家庄、沧州、保定、廊坊、张家口等七个地区规模化奶牛养殖场采集的175份奶样进行细菌分离培养、形态观察、生化试验等,从而对所分离的细菌进行鉴定。结果显示,从175份奶样中分离出了4种主要致病菌。其中,金黄色葡萄球菌有93株,占53.1%;无乳链球菌有85株,占48.6%;大肠杆菌共112株,占64%;绿脓杆菌共28株,占16%。在检出的奶样中大部分表现为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的混合感染,并且检出的28株绿脓杆菌均是由张家口地区和石家庄地区的奶样中分离得到,且其中的12株为单独感染。本试验根据引起奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌的nuc基因、无乳链球菌的ef-tu基因、大肠杆菌的phoA基因和绿脓杆菌的eta基因保守序列设计并合成4对特异性引物,所扩增目的片段的大小分别为920bp、515bp、268bp和126bp。通过对四种细菌的单一PCR检测法进行退火温度和引物浓度优化,最终确定单一PCR的最佳退火温度为54℃,上下游引物的添加量各1μL。特异性试验表明,四种单一PCR检测法特异性良好,无其他非特异性条带扩增;敏感性试验显示,金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的最低检出限分别为5.97×10~-55 ng/μL、3.6×10~-66 ng/μL、1.37×10~-77 ng/μL和1.2×10~-66 ng/μL。在此基础上,本研究建立了金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的多重PCR检测方法,并通过对其反应体系和反应条件的优化,确定多重PCR的最佳退火温度为54℃,各上下游引物的添加量均为1μL。特异性试验表明,多重PCR检测方法与克雷伯氏杆菌、表皮葡萄球菌、巴氏杆菌和水无交叉反应;敏感性试验表明,该方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的最低检出限分别为5.97×10~-22 ng/μL、3.6×10~(-3)ng/μL、1.37×10~-33 ng/μL和1.20×10~-33 ng/μL。应用本试验建立的多重PCR方法对临床62份乳房炎样品进行检测,结果显示金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的阳性率分别为43.5%(27/62),41.9%(26/62)、62.9%(39/62)和35.5%(22/62),其中,大肠杆菌混合感染率最高为40.3%(25/62),绿脓杆菌的混合感染率最低为20.9%(13/62)。该方法与传统的细菌分离培养法的总符合率分别为金黄色葡萄球菌90.3%,无乳链球菌95.2%,大肠杆菌91.9%,绿脓杆菌93.5%。以上数据表明,在乳房炎样品中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是奶牛乳房炎的优势菌。综上所述,本研究通过对河北部分区域奶样中致病菌的分离鉴定以及多重PCR检测方法的建立,为奶牛乳房炎致病菌病原检测试剂盒的研究奠定了基础,对本病的治疗和防控具有较大的指导意义。


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