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牛轮状病毒的分离鉴定和诊断方法的建立

彭志豪  
【摘要】:牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV),属于呼肠病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus),是引起犊牛腹泻病的主要病原之一。自1969年该病首次被报道以来,已相继在各国发生和流行,给养牛业造成严重的经济损失。该病以1月龄内犊牛腹泻、脱水为主要症状,且该病与其他病原引起的牛腹泻临床症状相似,难以区分,因此建立快速的诊断方法对BRV的防控具有重要的意义。本研究从河北省不同地区规模化牛场收集牛腹泻粪便样品,成功分离到一株可以稳定传代的细胞毒株,并对其VP6基因进行遗传进化分析和体外表达,并以表达的重组VP6蛋白为基础建立了检测BRV抗体的ELISA诊断方法,另外,据BRV、BCV的保守序列VP6、N基因建立双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究对我国BRV检测提供了快速有效的诊断方法,并对今后疫苗研发奠定了基础。为了解河北省牛群的BRV感染情况,本研究采用RT-PCR方法对2019年3月~6月采自河北省不同规模化牛场的72份腹泻样品进行检测,并选取经鉴定仅BRV为阳性,而能引起牛腹泻的其他病毒均为阴性的腹泻粪便样品处理后接种到Marc-145细胞上,进行病毒的分离,并对分离的毒株进行细胞病变观察,PCR鉴定、TCID50测定以及理化特性鉴定,结果显示,细胞在盲传5代后出现皱缩、变圆、边界不明显等病变,且RT-PCR鉴定为阳性,同时根据Reed-Muench法算得第15代毒TCID50为10-5.24/0.1mL,并对氯仿、乙醚和强酸耐受,但对热较敏感60℃ 10min即可使病毒完全失活,表明本研究成功分离出BRV毒株并命名为CH-HB-BD株。为了了解分离毒株的遗传变异情况,本研究对BRV CH-HB-BD株VP6基因进行了扩增和序列测定,并与国内外A型轮状病毒(RVA)VP6基因进行序列和氨基酸同源性进行分析,结果显示,分离株与来自美国的RVA G1 P8-3-50(登录号:KU956011)、RVAWC3(登录号:AF411322)和德国RVA 88977(登录号:KJ940164)亲缘关系最近,其中RVAWC3(登录号:AF411322)的同源性最高为96.4%,与氨基酸同源性分析结果一致,表明分离株VP6基因可以作为目的基因用于诊断方法的建立。此外,分离株同疫苗常用株RVANCDV(登录号:DQ870496)亲缘关系较近,序列同源性为95.8%,氨基酸位点仅发生3处改变,第122(I→L)、211(V→I)、349(I→V)。为了建立检测BRV抗体的血清学检测方法。本研究将分离株的VP6蛋白基因进行了表达,用Western对蛋白进行了反应原性的鉴定,并以重组VP6蛋白建立了检测牛血清中IgG抗体的间接ELISA方法,通过反应条件的优化确定了蛋白的最适包被条件为6μg/mL 4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂牛奶,同时将不同浓度的一抗二抗进行试验,确定最佳一抗稀释为1:500,二抗的稀释浓度为1:10000;此外,重复性试验和特异性试验结果显示,本试验建立的ELISA方法具有良好的重复性和特异性,组内组间变异系数均小于7%,且与牛冠状病毒(BCV)、牛病毒性腹泻(BVDV)和牛诺如病毒(BNoV)无交叉反应;通过检测30份BRV阴性血清算得临界值为0.290,临床285份样品检测结果显示144份样品为阳性,占50.1%(144/285)。本研究根据GenBank中已登录的BRV VP6基因和BCV N基因设计引物和探针,通过方阵法优化体系后,建立了一种可以同时检测BRV和BCV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。该方法特异性强,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛细小病毒(BPV)、牛肠道病毒(BEV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对BRV和BCV重组质粒标准品的最低检测限分别为41.8拷贝/μL和3.55拷贝/μL,敏感性高;组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性较好。用已建立好的方法对本实验室于2019年3月~9月在河北省内采集的72份牛腹泻样品进行检测,检测结果显示BRV的阳性率为50.0%(36/72),BCV的阳性率为75.0%(54/72),BRV和BCV共感染率为33.3%(24/72),优于常规PCR方法。本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法对BRV和BCV的临床病原检测和流行病学调查具有重要意义。


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