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普罗布考对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠血脑屏障的干预作用及可能机制

任国勇  
【摘要】:目的:多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种常见的中枢神经系统(central nervous system,CNS)自身免疫性脱髓鞘疾病,其确切的病因及发病机制尚不清楚。完整的血-脑屏障(blood-brain barrier, BBB)是神经组织发挥正常功能的重要前提。MS发病时在炎性细胞侵入中枢神经系统CNS之前,必须先穿过BBB,一旦BBB遭到破坏则不能维持CNS的自稳状态,这可能就是MS发病的基础。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)与人类MS在临床、免疫及病理等多方面有相同特征,是国际公认的研究MS的理想动物模型。 紧密连接(tight junction, TJ)构成了BBB的第一道屏障。TJ由跨膜蛋白(occludin)、胞浆附着蛋白(ZO)与细胞骨架蛋白(actin)相连而组成。ZO在连接occludin和actin中起桥梁作用,其中ZO1分布于多种上皮细胞和内皮细胞的闭锁小带中,它可以敏感地反应出病理情况下屏障的损害,是检测内皮细胞屏障结构和功能的良好指标。 免疫学因素及氧化应激在MS发病中起着关键性作用。近年来随着对Th17细胞的深入研究人们发现氧化应激失衡、IL-23/IL-17炎性轴对MS起着重要的作用。普罗布考是一种被摄入后能够富积于LDL并易于进入动脉内膜的抗氧化的物质,主要用于降脂,但其同时能够调节炎性因子,发挥抗炎作用。普罗布考作为抗氧化物质,能否影响MS的发病及作用的靶点尚未见报道。本实验拟通过观察普罗布考对EAE大鼠干预后血脑屏障损伤指标、免疫学及氧化应激指标的相应动态变化,观察其是否对EAE发病具有保护作用,从而为临床治疗MS提供新的思路。 方法:(1)动物分组:将120只雌性,6-8周龄,体重200g左右的Wistar大鼠,随机分为正常对照组,EAE组,普罗布考-EAE组(500mg/kg/d灌胃),醋酸泼尼松-EAE组(5mg/kg/d灌胃),每组30只。每组按免疫后0,3,7,10,14,21天6个时间点,随机分为6个亚组,每个亚组5只。(2)动物模型的建立:取体重350g左右清洁级雌性豚鼠全脊髓,按脊髓重量与冰盐水体积为1:10,制成脊髓匀浆,再与等量完全福氏佐剂充分混合,佐剂中含卡介苗为6mg/ml。冰上抽打制成油包水乳剂,乳化后按0.5ml/只分别于大鼠四肢足垫及背部皮下注射,建立EAE动物模型。药物治疗组在模型制备的当天给予相应剂量的药物灌胃,每天1次,直至动物处死。(3)神经功能评分:免疫当天及免疫后每天,观察动物精神状态、活动情况及称重,并进行神经功能评分。评分采用国际通用的Kono评分标准。(4)检测指标:冠状位取大鼠脑组织中视交叉前后2mm组织制作石蜡包块,用免疫组织化学法测定ZO-1的表达。ELISA试剂盒检测血清IL-23及MDA含量。 结果:(1)大鼠发病情况:抗原免疫诱导后7天内各组无大鼠发病,11天左右EAE组逐渐出现精神萎靡,食欲不振,体重减轻,皮毛不光滑等情况,12~14天发病达高峰,17~21天症状逐渐缓解。普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组大鼠发病时间较EAE组推迟(13.20±0.84vs11.89±0.06,14.50±0.58vs11.89±0.06;P0.05),第14天时神经功能评分较EAE组减小(1.00±1.15vs2.80±1.40,0.80±1.14vs2.80±1.40;P0.05)。正常对照组无大鼠发病。(2)组织病理学改变:同时选取对照组、EAE组、普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组大鼠脊髓腰膨大处组织行HE染色,在光镜下观察其病理变化。我们发现在EAE大鼠在7天时已经出现炎性细胞浸润,14天时脊髓炎性细胞浸润最为明显,在血管周围可见“袖套样”浸润。普罗布考-EAE、醋酸泼尼松-EAE组也可见炎性细胞浸润,但浸润程度较EAE组明显减轻。(3)免疫组化结果:EAE组ZO-1阳性细胞数呈先下降后上升的趋势,7天组明显下降,14天组下降达高峰,21天组缓慢上升。ZO-1下降达高峰时大鼠症状最重,提示临床与病理结果一致,并且在发病前已有神经功能损伤。EAE组ZO-1阳性细胞数7天组与3天组比较明显下降(0.1770±0.0354vs0.2562±0.0133,P0.05),10天较7天时下降不明显(0.1517±0.0158vs0.1770±0.0354,P0.05),10天与3天比较明显下降(0.1517±0.0158vs0.2562±0.0133,P0.05);EAE14天组较同组其余亚组下降明显(P0.05);EAE组在14天、21天较同期普罗布考-EAE、醋酸泼尼松-EAE组明显下降(P0.05)。(4)血清IL-23含量比较:血清IL-23含量比较:在免疫10天、14天、21天时EAE组IL-23的含量较同期对照组明显升高(161.99±56.25pg/m1vs77.98±10.41pg/m1,195.04±88.52pg/m1vs81.11±16.49pg/m1,127.19±26.02pg/m1vs79.17±14.14pg/m1,P0.05);免疫10天时EAE组大鼠IL-23的含量出现明显升高,14天时仍有升高但较10天时无统计学意义。而普罗布考-EAE组、醋酸泼尼松-EAE组较同期对照组变化不大(P>0.05)。普罗布考-EAE与醋酸泼尼松-EAE两组间在各时间点比较IL-23含量变化不明显(P0.05)。(5)血清MDA含量比较:在免疫10天、14天、21天时EAE组MDA的含量较同期对照组明显升高(6.63±0.39nmol/ml vs4.84±0.06nmol/ml,9.34±0.40nmol/ml vs4.82±0.07nmol/ml,5.20±0.13nmol/ml vs4.82±0.11nmol/ml,P0.05);而在0天、3天、7天时EAE组MDA的含量较同期对照组变化不大(4.80±0.20nmol/ml vs4.79±0.78nmol/ml,4.84±0.13nmol/ml vs4.78±0.11nmol/ml,4.93±0.14nmol/ml vs4.82±0.08nmol/ml,P0.05)。免疫10天、14天时除普罗布考-EAE、醋酸泼尼松-EAE两组间无明显差异(P0.05)外,其余各组间两两比较差异明显(P0.05)。 结论: 1EAE大鼠临床发病前就有血脑屏障的破坏。 2EAE发病高峰期ZO-1下降最明显,上调ZO-1的表达,进而保护血脑屏障是普罗布考可能的机制之一。 3普罗布考可以推迟EAE大鼠的发病时间,减轻疾病对神经系统功能损害。 4普罗布考能够抑制EAE大鼠血清IL-23的表达水平,减少MDA的产生,提示普罗布考治疗MS的机制可能与此有关。 5普罗布考与醋酸泼尼松相比,虽然醋酸泼尼松在推迟发病时间上优于普罗布考,但普罗布考更安全,耐受性更好。


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