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曲克芦丁对STZ糖尿病大鼠认知功能障碍及海马谷氨酸半胱氨酸连接酶亚单位GCLC、GCLM的影响

李红岩  
【摘要】:目的:糖尿病是当代危害人类健康的三大疾病之一,糖尿病中枢神经系统病变是目前研究热点之一,主要表现为认知功能障碍如学习、记忆能力下降。氧化应激是其重要发病机制之一。过氧化脂质(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是反映体内的氧化应激水平的经典指标。SOD、GSH均具有很强的抗氧化能力,谷氨酰半胱氨酸连接酶(Glutamatecysteine ligase,GCL)是GSH的合成限速酶,其催化亚基GCLC和调节亚基GCLM是非常重要的抗氧化蛋白酶,对抗氧化应激能力的提高有重要作用。本实验以α-硫辛酸为对照,观察曲克芦丁对认知功能及氧化应激相关指标(MDA,SOD,GSH,GCLC,GCLM)的影响,为糖尿病认知障碍治疗提供新方向。 方法: 1STZ糖尿病大鼠模型制备 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)60mg/kg,72小时后尾静脉取血测血糖,血糖值大于等于16.7mmol/L者纳入STZ糖尿病大鼠。 2分组 SD大鼠共70只,150g-170g,随机分为:正常对照组(NC,10只),糖尿病组(DM,60只);动物成模后第12周,糖尿病组随机分为:生理盐水组(DN,腹腔注射等体积生理盐水,15只),糖尿病对照组(DC,15只),α-硫辛酸干预组(DL,α-硫辛酸60mg/kg/d腹腔注射,15只),曲克芦丁干预组(DT,曲克芦丁60mg/kg/d腹腔注射,15只),均干预6周。 3一般观察 大鼠精神状态,进食量,进水量,尿量,血糖,体重情况。 4行为学观察 分别于成模第1、12、18周行Morris水迷宫实验,记录大鼠逃避潜伏期,分析各组大鼠学习记忆能力。 5标本制备及观察指标 成模第18周(即给药6周后),取新鲜海马组织,用HE染色法观察海马组织结构,应用黄嘌呤氧化酶法测定海马SOD的活力,硫代巴比妥酸法测定海马MDA含量,双缩脲法测定GSH含量,提取DNA并应用Real-Time PCR法检测GCLC、GCLM mRNA的表达量,提取蛋白应用蛋白质印迹(Western blot)法检测GCLC、GCLM蛋白含量。 6统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包,对所测定结果进行正态性及方差齐性检验,应用重复测量方差分析、多元方差分析及完全随机设计的单因素方差分析统计数据,用x±s表示统计结果,P<0.05为差异有统计学意义。 结果: 1一般情况观察 正常对照组大鼠皮毛纯白有光泽,精神状态良好,反应灵敏,饮水量、进食量及尿量正常,体重稳步增长;糖尿病组大鼠毛色稀疏枯黄污秽且无光泽,皮肤变薄,易激惹,精神萎靡,多尿、多饮、多食、体重明显下降(P0.05),血糖较正常组明显升高(P<0.01)。 2行为学观察(Morris水迷宫结果) 成模第1周,糖尿病组与正常对照组间无显著差别(P>0.05); 成模第12周(药物干预前),糖尿病组较正常对照组逃避潜伏期明显延长(P<0.05); 成模第18周(药物干预6周后),α-硫辛酸干预组与曲克芦丁干预组均较糖尿病对照组及糖尿病盐水组逃避潜伏期明显缩短,但仍高于正常对照组(P<0.05);α-硫辛酸干预组与曲克芦丁干预组间无显著差异(P>0.05);糖尿病盐水组与糖尿病对照组间无显著差异(P>0.05),组别和天数之间不存在交互作用(P>0.05)。 3海马组织GCLM mRNA及蛋白的表达 3.1海马组织GCLM mRNA的表达 与正常对照组(1±0)相比,糖尿病对照组(0.790±0.012)、糖尿病盐水组(0.863±0.097)海马GCLM mRNA的表达显著降低(P<0.05);糖尿病对照组与糖尿病盐水组间无显著差异(P>0.05)。与糖尿病对照组及糖尿病盐水组相比,α-硫辛酸干预组(1.510±0.115)与曲克芦丁干预组(1.207±0.011)海马GCLM mRNA的表达显著增高(P<0.05);α-硫辛酸干预组GCLM mRNA表达高于曲克芦丁干预组(P<0.05)。 3.2海马组织GCLM蛋白表达 正常对照组(1±0)、糖尿病对照组(0.999±0.003)、糖尿病盐水组(1.000±0.002)、α-硫辛酸干预组(0.999±0.001)、曲克芦丁干预组(0.999±0.002)之间无明显差异。 4海马组织GCLC mRNA及蛋白的表达 4.1海马组织GCLC mRNA及蛋白的表达 与正常对照组(1±0)相比,糖尿病对照组(0.642±0.118)、糖尿病盐水组(0.660±0.123)海马GCLM mRNA的表达显著降低(P<0.05);糖尿病对照组与糖尿病盐水组间无显著差异(P>0.05)。与糖尿病对照组及糖尿病盐水组相比,α-硫辛酸干预组(1.245±0.128)与曲克芦丁干预组(1.181±0.131)海马GCLM mRNA的表达显著增高(P<0.05);α-硫辛酸干预组与曲克芦丁干预组无显著差异(P>0.05)。 4.2海马组织GCLC蛋白的表达 与正常对照组(1±0)相比,糖尿病对照组(0.989±0.002)、糖尿病盐水组(0.989±0.001)海马GCLC蛋白水平显著降低(P<0.05);糖尿病对照组与糖尿病盐水组间无显著差异(P>0.05)。与糖尿病对照组及糖尿病盐水组相比,α-硫辛酸干预组(1.009±0.003)与曲克芦丁干预组(1.002±0.001)海马GCLC蛋白水平显著增高(P<0.05);α-硫辛酸干预组蛋白表达高于曲克芦丁干预组(P<0.05)。 5海马组织中SOD活性及MDA、GSH含量测定 5.1SOD活性(U/mgprot) 与正常对照组(115.976±7.581)相比,糖尿病对照组(61.806±3.942)、糖尿病盐水组(68.237±7.632)海马SOD活性明显降低(P<0.05);糖尿病对照组与糖尿病盐水组间无显著差异(P>0.05)。与糖尿病对照组及糖尿病盐水组相比,α-硫辛酸干预组(200.331±6.181)与曲克芦丁干预组(191.985±11.421)海马SOD活力明显升高(P<0.05),并且高于正常对照组(P<0.05);α-硫辛酸干预组与曲克芦丁干预组间无显著差异(P>0.05)。 5.2MDA含量(nmol/mgprot) 与正常对照组(2.737±0.208)相比,糖尿病对照组(3.841±0.109)、糖尿病盐水组(3.722±0.196)海马MDA含量明显升高(P<0.05);糖尿病对照组与糖尿病盐水组间无显著差异(P>0.05)。与糖尿病对照组及糖尿病盐水组相比,α-硫辛酸干预组(2.022±0.228)与曲克芦丁干预组(2.534±0.197)海马MDA含量明显降低(P<0.05);曲克芦丁干预组与正常对照组间无显著性差别(P>0.05),α-硫辛酸干预组海马MDA含量低于曲克芦丁干预组及正常对照组(P<0.05)。 5.3GSH含量(mg/gprot) 糖尿病对照组(2.117±0.158)和糖尿病盐水组(2.114±0.150)均低于正常对照组(2.657±0.207)(P<0.01);糖尿病对照组和糖尿病盐水组相比无统计学差异(P>0.05);α-硫辛酸干预组(4.337±0.174)和曲克芦丁干预组(3.634±0.177)与糖尿病对照组和糖尿病盐水组相比均增高(P<0.01);α-硫辛酸干预组高于曲克芦丁干预组(P<0.01)。 6HE染色结构 正常对照组大鼠海马椎体细胞元排列整齐,形态完整;糖尿病对照组及糖尿病盐水组细胞数目减少,细胞膜及核仁模糊,细胞结构被破坏,核固缩,细胞质减少;α-硫辛酸干预组及曲克芦丁干预组较糖尿病对照组及糖尿病盐水组上述改变明显减轻。 结论: 1STZ糖尿病大鼠的学习记忆能力明显下降;与学习记忆密切相关的海马组织中:重要的抗氧化物质SOD、GSH显著减低,合成GSH的关键酶GCLC、GCLM的表达亦减少;氧化应激产物MDA的产生增加。 2α-硫辛酸可改善STZ糖尿病大鼠学习记忆能力,提高海马组织中SOD、GSH及GCLC、GCLM的表达,降低MDA的生成。 3曲克芦丁亦可改善STZ糖尿病大鼠学习记忆能力,其作用与α-硫辛酸相当,但其在提高海马组织中SOD、GSH、GCLC、GCLM表达及降低MDA生成的能力弱于α-硫辛酸。


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