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补肾法、疏肝法对体外培养IVF-ET患者卵巢颗粒细胞中ACTA及其Smads信号通路的影响

田茜华  
【摘要】:目的:前期研究证实,补肾法、疏肝法具有提高体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)患者临床妊娠率、改善妊娠结局、提高卵母细胞质量的作用,本研究拟通过观察补肾法、疏肝法对IVF-ET患者体外培养卵巢壁颗粒细胞ACTA及其信号通路的调控作用,以探讨两法促进卵泡发育、提高卵母细胞质量作用机制及其途经的异同。方法:1含药血清制备补肾调经方、逍遥散方含药血清:选取年龄在20-30岁,身体健康,月经规律,B超显示有成熟卵泡,且无卵巢、子宫器质性疾病的女性志愿者10名,分别服用补肾调经方和逍遥散方。补肾调经方、逍遥散方服用方法是每日1剂,300ml,早晚分服。补肾调经方和逍遥散方连续服药3天,第4天清晨空腹服用全天剂量药物(服药前禁食12h),于末次服药1h后静脉取血5ml,室温静置2h,3000r/min离心10min,取上清,56℃水浴30 min灭活补体,0.22μm无菌滤器过滤除菌、分装制备补肾调经方、逍遥散方两种人含药血清。正常血清:选取年龄在20-30岁,身体健康,月经规律,B超显示有成熟卵泡,且无卵巢、子宫器质性疾病的女性志愿者5名,清晨空腹静脉采血5ml,同上制备正常人血清,设为正常血清对照。以上血清均-20℃保存备用。2卵巢壁颗粒细胞培养将含有颗粒细胞的卵泡液经梯度离心后获得壁颗粒细胞,于35mm培养皿中置2ml培养液,37℃、5%CO2(V/V)、100%湿度培养,24h后细胞贴壁。分别加入补肾调经方和逍遥丸含药血清,分为补肾组和疏肝组,补肾含药血清组与疏肝含药血清组分别设置低、中、高三个剂量组,正常血清为正常组,不加血清为空白组。继续培养24h后,收集颗粒细胞。第一批采用机械方法收集颗粒细胞,置于-80℃保存备用(用于实时荧光定量PCR)。第二批采用机械与酶结合的方法,迅速放入2%多聚甲醛中固定(分别用于免疫组化和免疫荧光)。补肾高剂量组与疏肝高剂量组在中药孵育24h后,加入SB431542(浓度为10μmol/L),继续孵育2h,分别为补肾阻断剂组和疏肝阻断剂组,收集与实验方法同上。采用实时荧光定量PCR检测ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA的表达;采用免疫组化法、免疫荧光法检测颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4以及P-Smad2、P-Smad3蛋白的表达。结果:1体外培养各组卵巢壁颗粒细胞ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA的表达1.1正常组、空白组以及各治疗组之间颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达比较正常组较空白组颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达升高(P0.05)。与空白组、正常组比较,疏肝低、中、高剂量组颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达均升高(均P0.05);且疏肝高剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达高于疏肝中剂量组及疏肝低剂量组(均P0.05);疏肝中剂量组表达高于疏肝低剂量组(P0.05),呈剂量依赖性。与正常组、空白组比较,补肾低、中、高剂量组的颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达升高(均P0.05);且补肾高剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达较补肾中、低剂量组均升高(均P0.05),呈剂量依赖性。疏肝低、中、高剂量组与补肾低、中、高剂量组之间比较,补肾高剂量组颗粒细胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA的表达最高,差异有统计学意义(P0.05),其余各组表达由高至低依次是补肾中剂量组、疏肝高剂量组、疏肝中剂量组、补肾低剂量组、疏肝低剂量组,差异具有统计学意义(P0.05)。1.2疏肝、补肾阻断剂组与非阻断剂组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达比较与疏肝阻断剂组比较,疏肝高剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达明显升高(均P0.05);疏肝中剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达无差异(P0.05);空白组、正常组与疏肝低剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达下降(均P0.05)。与补肾阻断剂组比较,补肾高剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA表达明显升高(均P0.05);补肾中剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达无差异(P0.05);空白组、正常组与补肾低剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA表达下降(均P0.05)。2各组之间体外培养卵巢壁颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表达2.1免疫组化结果2.1.1正常组、空白组以及各治疗组之间颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达比较正常组与空白组之间比较,正常组颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达均高于空白组(均P0.05)。与空白组、正常组比较,疏肝低、中、高剂量组颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达升高(均P0.05);且疏肝高剂量组蛋白表达最高,其次为疏肝中、低剂量组,呈剂量依赖性。与正常组、空白组比较,补肾低、中、高剂量组的颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达升高(均P0.05);且补肾高剂量组蛋白表达最高,其次为补肾中剂量组和补肾低剂量组,呈剂量依赖性。疏肝低、中、高剂量组与补肾低、中、高剂量组之间比较,补肾高剂量组较疏肝高剂量组ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表达升高,但无统计学意义(P0.05),补肾中剂量组较疏肝中剂量组蛋白表达均升高(P0.05),补肾低剂量组与疏肝低剂量组差异无统计学意义(P0.05)。2.1.2疏肝、补肾阻断剂组与非阻断剂各组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达比较与疏肝阻断剂组比较,疏肝高剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、P-Smad2、P-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达明显升高(均P0.05);疏肝中剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达无差异(P0.05);空白组、正常组与疏肝低剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达下降(均P0.05)。与补肾阻断剂组比较,补肾高剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达明显升高(均P0.05);补肾中剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达无差异(P0.05);空白组、正常组与补肾低剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达下降(均P0.05)。2.2细胞免疫荧光结果2.2.1正常组、空白组以及各治疗组之间颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达比较正常组与空白组之间比较,正常组颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达均高于空白组(均P0.05)。与空白组、正常组比较,疏肝低、中、高剂量组颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达升高(均P0.05);且疏肝高剂量组蛋白表达最高,其次为疏肝中、低剂量组,呈剂量依赖性。与正常组、空白组比较,补肾低、中、高剂量组的颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达升高(均P0.05);且补肾高剂量组蛋白表达最高,其次为补肾中剂量组和补肾低剂量组,呈剂量依赖性。疏肝低、中、高剂量组与补肾低、中、高剂量组之间比较,补肾高剂量组较疏肝高剂量组ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表达升高,但无统计学意义(P0.05),补肾中剂量组较疏肝中剂量组蛋白表达均升高(P0.05),补肾低剂量组与疏肝低剂量组差异无统计学意义(P0.05)。2.2.2疏肝、补肾阻断剂组与非阻断剂各组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达比较与疏肝阻断剂组比较,疏肝高剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达明显升高(均P0.05);疏肝中剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达无差异(P0.05);空白组、正常组与疏肝低剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、P-Smad2、P-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达下降(均P0.05)。与补肾阻断剂组比较,补肾高剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达明显升高(均P0.05);补肾中剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达无差异(P0.05);空白组、正常组与补肾低剂量组ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表达下降(均P0.05)。结论:1逍遥散方和补肾调经方含药血清可以提高体外培养卵巢颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4 m RNA及蛋白的表达,增强ACTA促进卵泡生长发育、提高卵母细胞质量的作用。2逍遥散方和补肾调经方影响ACTA信号通路的作用呈剂量依赖性,即高剂量效果最优。3补肾调经方含药血清在提高体外培养卵巢颗粒细胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4 m RNA及其蛋白的表达作用比逍遥散方更显著,提示补肾调经方促进卵泡生长发育、提高卵母细胞质量优于逍遥散方。4逍遥散方和补肾调经方可通过上调ACTA及其Smads信号通路来发挥其促进卵泡生长发育和提高卵母细胞质量的作用,其机制可能是诱导ACTA与其Ⅱ型受体ACTRⅡB形成复合物,进而募集Ⅰ型受体ALK4,使其发生磷酸化而活化,进一步磷酸化细胞内的信号因子Smad2、Smad3、Smad4,进而调控信号转导。


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