刚地弓形虫RH株ROP10基因真核表达载体的构建及其免疫原性分析

【摘要】：目的:弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生虫。该虫是重要的机会性致病原虫,寄生于人体及动物的有核细胞内,可感染人体和全球200多种动物,引起弓形虫病。据估计全世界30%的人群感染本虫。免疫功能低下和新生儿是弓形虫病的最大受害者,可引起严重的后果,直接影响到人类的健康和社会的发展,同时对食品公共卫生安全和畜牧业也造成了一定程度的隐患和危害,而目前尚没有理想的防治弓形虫病的药物,所以研制安全有效的疫苗预防该病尤为重要。研究表明弓形虫棒状体蛋白由棒状体分泌,对弓形虫侵入宿主细胞并对其发挥毒力方面均起着重要的作用,在疫苗研制方面具有很大的潜力。本研究通过分子生物学方法构建了重组质粒p VAX1-ROP10,并将其肌肉注射免疫BALB/c小鼠,为进一步研究弓形虫ROP10基因核酸疫苗提供实验基础。方法:提取弓形虫RH株速殖子总RNA,根据已发表的ROP10基因序列(登录号为DQ124368)设计引物并进行ROP10基因的逆转录PCR(RT-PCR)扩增,将扩增的目的片段ROP10基因克隆至真核表达质粒p VAX1上,构建重组质粒p VAX1-ROP10,并通过菌落PCR、酶切分析、基因测序的方法对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到制备好的感受态大肠埃希菌(E.coli)XL1-Blue内,筛选阳性克隆后扩大培养,提取质粒,之后通过lipofectamine阳离子脂质体转染试剂将p VAX1-ROP10重组质粒转染至He La细胞内,提取He La细胞的总RNA,分别进行β-acting基因和ROP10基因的RT-PCR扩增,其RT-PCR扩增产物用电泳验证以检验ROP10基因是否在He La细胞内表达。将重组质粒通过肌肉注射方式免疫8周龄BALB/C小鼠,每隔两周免疫一次,在每次注射免疫前和末次注射免疫后的第二周采集小鼠血清,采用间接ELISA法检测血清中抗体Ig G水平和细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10)的水平,并观察各组小鼠的存活时间。结果:经RT-PCR扩增ROP10基因产物为1761 bp,成功构建重组质粒p VAX1-ROP10,并经菌落PCR、Eco R I和Not I双酶切分析和基因测序得到证实。将重组质粒p VAX1-ROP10转染至He La细胞并提取总RNA后,β-actin基因和ROP10基因的RT-PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳验证分别在613bp处和1761bp处有明亮条带,与预期片段大小相符,证明了ROP10能够在体外真核细胞内表达。小鼠免疫接种后,实验组小鼠血清中的Ig G抗体随着免疫次数的增加而有明显地升高,但空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组相应的血清中均未出现明显升高。末次免疫后2周,实验组小鼠血清中Ig G抗体水平明显升高,与其他对照组相比有统计学差异(P0.05)。小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的水平(pg/ml),实验组分别为465.31±12.21、168.52±11.22、150.35±11.34、166.00±12.34。空质粒组分别为50.32±6.73、48.63±6.02、52.00±6.83、53.67±5.94。PBS对照组分别为47.02±4.68、42.34±5.24、47.30±5.23、50.63±5.94。空白对照组分别为48.39±5.23、46.32±5.25、49.23±7.84、50.00±6.82。实验组的细胞因子水平明显升高,与空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组比较有统计学差异(P0.05)。抗感染免疫保护实验表明,与其它对照组比较,实验组小鼠平均存活时间明显延长(P0.05)。结论:本研究成功构建了ROP10表达载体p VAX1-ROP10,并成功在He La细胞中表达,用p VAX1-ROP10重组质粒对小鼠进行免疫后能增强小鼠的免疫应答,为ROP10核酸疫苗的进一步研究提供了实验基础。