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间皮素在卵巢上皮癌中的诊断价值及负载间皮素的DC疫苗抗卵巢癌细胞效应的研究

王东晖  
【摘要】:卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,90%的卵巢癌为卵巢上皮癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC),其死亡率居各种生殖器官肿瘤的首位。卵巢癌早期缺乏特异性症状,一旦确诊往往已经是晚期。早期患者5年生存率能够达到90%,晚期患者的5年生存率仅为5-20%。绝大多数患者经过肿瘤细胞减灭术以及紫杉醇与铂类联合化疗后只能在一段时期内病情得到缓解,最终出现化疗抵抗而死亡。因此,寻找新的早期诊断筛查指标、寻找特异有效的治疗方法是提高卵巢癌患者生存率亟待解决的问题。间皮素(Mesothelin,MSLN)是一种分子质量为40KDa的细胞表面糖蛋白,通常只在人体体腔表面的间皮细胞表达,在其他正常组织中不表达,但是在一些恶性肿瘤如间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等中过度表达。研究证实间皮素在肿瘤细胞生存、侵袭和肿瘤进展方面起着重要作用。间皮素与CA125有很高的亲和力,二者共同作用参与细胞粘附,与肿瘤的腹腔种植转移有关。可溶性间皮素相关蛋白(Soluble mesothelin related protein,SMRP)是分子量为42-45KDa的蛋白,是由间皮素基因编码蛋白的其中一个异构体在翻译过程中翻译提前终止,从细胞表面脱落形成。SMRP分子量小,它不仅在血清中可以检测到,在腹水和尿液中同样可以检测到。因此,SMRP有可能成为卵巢癌早期诊断的筛查指标,而且间皮素组织特异性表达方式使它成为理想的肿瘤免疫治疗的靶点。肿瘤疫苗是免疫治疗的重要组成部分,是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原诱导机体产生特异性免疫反应,达到清除肿瘤细胞的目的。树突状细胞(Dendritic Cell,DC)疫苗是肿瘤疫苗的一种。DC是体内最强的抗原递呈细胞,能够摄取肿瘤抗原,诱导生成细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL),从而介导强有力的特异性抗肿瘤细胞免疫。近几年来,关于卵巢癌DC疫苗的研究已经取得了一定的成果。本课题首先检测卵巢上皮癌、良性卵巢上皮肿瘤、正常人群血清及尿液间皮素水平,将其与血清CA125的临床价值作同期比较;同时将尿液及血清间皮素分别联合血清CA125检测作为卵巢上皮癌诊断的临床价值作出客观评价。然后采用PCR技术克隆间皮素全长的c DNA,通过测序证实序列正确后,提取无内毒素的间皮素质粒,再制备负载间皮素c DNA的慢病毒载体,并对其进行鉴定。最后应用负载人间皮素全长c DNA的慢病毒感染DC,构建卵巢上皮癌的新型DC疫苗,通过Western Blot技术验证病毒转染的DC强烈表达间皮素,进而通过DC作为间皮素的递送细胞,诱导产生具有间皮素特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL),通过LDH释放法、流式细胞术、IFN-γ检测等一系列方法测定CTL对卵巢上皮癌细胞产生特异性杀伤作用。期望通过本课题研究为卵巢癌的早期诊断和免疫治疗提供新的研究思路。第一部分血清及尿液中间皮素检测在卵巢上皮癌中的诊断价值目的:检测血清及尿液中的SMRP水平在卵巢上皮癌、良性卵巢上皮肿瘤及健康女性中的分布情况,并且与血清CA125的临床诊断价值作比较,同时将血清及尿液SMRP分别联合血清CA125检测作为卵巢上皮癌诊断的临床价值作出客观评价。方法:用酶联免疫吸附试验方法检测46例卵巢上皮癌患者、36例良性卵巢上皮肿瘤患者和35例健康女性血清和尿液中的SMRP水平,同时用化学发光法检测血清CA125水平。分析血清SMRP及尿液SMRP在卵巢上皮癌患者不同病理类型、不同手术病理分期和不同病理分级的分布差异,也对良性卵巢上皮肿瘤不同病理类型患者分布作出比较。通过绘制ROC曲线对三种检测方法的诊断效能作出评价,并评价血清及尿液SMRP分别联合血清CA125检测的诊断价值。结果1卵巢上皮癌患者的血清SMRP(17.63±2.18ng/ml)和尿液SMRP(11.26±1.43ng/ml)水平均高于良性卵巢上皮肿瘤患者(血清SMRP4.62±0.71ng/ml;尿液SMRP 2.84±0.47ng/ml)和健康体检者(血清SMRP2.99±0.36ng/ml;尿液SMRP 0.89±0.31ng/ml),差异有统计学意义(P0.05)。2浆液性癌的血清SMRP水平显著高于粘液性癌和子宫内膜样癌,差异有统计学意义(P0.05)。粘液性癌和子宫内膜样癌间比较差异不显著(P0.05)。三种病理类型的卵巢上皮癌患者的尿液SMRP水平比较,差异没有统计学意义(P0.05)。3晚期癌患者血清和尿液SMRP水平均较早期患者明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。4 G3组的血清和尿液SMRP水平均明显高于G1组和G2组,差别均具有统计学意义(P0.05),G1组和G2组比较差异无显著性(P0.05)。5绘制血清SMRP、尿液SMRP和血清CA125的ROC曲线,血清SMRP的ROC曲线下面积(Area under ROC curve,AUC)为0.822,标准误0.42,其95%的可信区间为(0.740-0.905);尿液SMRP的AUC为0.787,标准误0.46,其95%的可信区间为(0.697-0.877);血清CA125的AUC为0.814,标准误0.49,其95%的可信区间为(0.719-0.910)。6血清CA125灵敏度最高(76.1%),但其特异度最低(85.5%)。血清SMRP的灵敏度(71.7%)较CA125略低,特异度(89.8%)较其增加。尿液SMRP的特异度最高(93.4%),敏感度最低(67.4)。7对三指标进行Kappa一致性检验,血清SMRP的Kappa值为0.617(P=0.000),尿SMRP的Kappa值为0.628(P=0.000),CA125的Kappa值为0.590(P=0.000)。8血清SMRP与CA125进行并联联合检测灵敏度最高(93.2%),尿液SMRP与CA125串联联合检测特异度最高(99%)。三者的联合使敏感度略增加,但并不能提高特异度。结论1卵巢上皮癌组的血清SMRP水平显著高于良性上皮性肿瘤组和健康对照组;浆液性癌患者较粘液性癌和子宫内膜样癌患者血清SMRP水平显著升高;晚期患者的血清SMRP水平显著高于早期患者;组织学分级越差的患者血清SMRP水平越高。2卵巢上皮癌组的尿液SMRP水平显著高于良性上皮性肿瘤组和健康对照组;浆液性癌患者较粘液性癌和子宫内膜样癌患者尿液SMRP水平高,但是差异不显著;晚期患者的尿液SMRP水平显著高于早期患者;组织学分级越差的患者尿液SMRP水平越高。3三指标比较,血清CA125灵敏度最高,但其特异度最低。血清SMRP的灵敏度较CA125略低,特异度较其增加。尿液SMRP的特异度最高,但灵敏度最低。在诊断一致性方面,尿液SMRP优于血清SMRP和血清CA125,血清SMRP略优于CA125。证实了血清和尿液SMRP检测用于诊断卵巢上皮癌的应用价值。4血清SMRP与CA125进行并联联合检测灵敏度最高,尿液SMRP与CA125串联联合检测特异度最高。血清、尿液SMRP检测可以在一定程度上弥补CA125作为卵巢癌早期诊断标志物的不足。第二部分间皮素c DNA的克隆及慢病毒载体的构建目的:构建负载间皮素全长c DNA的慢病毒载体。方法:应用PCR技术克隆间皮素基因全长序列的c DNA,通过测序证实序列正确后,构建p BOB-1质粒表达载体,再制备负载间皮素c DNA的慢病毒载体,并对其进行滴度检测。结果1经过两轮PCR获到了大约2000bp的PCR产物,经测序验证获得了编码间皮素(MSLN)的c DNA全长序列,其编码区为1893 bp,编码630个氨基酸的蛋白质。2将MSLN编码区c DNA两端分别含有Age I和Xho I酶切位点的PCR产物和经过双酶切的p BOB-1质粒载体进行连接反应,获得了用于转染慢病毒的p BOB-MSLN质粒载体,并用微量分光光度计K5600检测质粒的纯度。3成功构建MSLN全长基因c DNA的慢病毒载体,用定量PCR方法测定病毒颗粒的滴度为6.56×106±2.1×105 TU/ml。结论1使用含有人间皮素编码基因的c DNA文库菌体,采用PCR扩增的方法,经过两轮PCR得到的产物,经测序验证获得了编码间皮素(MSLN)的c DNA全长序列。2本实验中使用的慢病毒载体系统是四质粒系统的p BOB(p CSC-SP-PW),并用293T细胞包装慢病毒颗粒。该载体具有宿主范围广,转移基因片段容量大,不易诱发宿主免疫反应等优点,更为重要的是该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。构建负载间皮素全长c DNA的慢病毒载体成功后检测病毒滴度满意。第三部分 负载间皮素全长cDNA的DC疫苗抗卵巢癌细胞OVCAR3和SKOV3效应的研究目的:构建负载间皮素全长c DNA的DC疫苗,利用DC的抗原递呈功能,以成熟DC为载体将间皮素递呈给淋巴细胞,诱导产生针对间皮素的特异性细胞毒性T淋巴细胞,验证其对卵巢上皮癌肿瘤细胞产生强大的特异性细胞杀伤作用。方法1培养卵巢癌细胞株OVCAR3和SKOV3,用Western Blot方法测定两个细胞株间皮素的表达情况。2成熟DC的获得和检测:从外周健康新鲜血中分离获得人外周血单核细胞,先后加入GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子培养9天,收获成熟的DC。用流式细胞仪检测成熟DC表面的CD80,CD83,CD86分子表达情况。3重组慢病毒感染DC:用构建好的负载间皮素全长c DNA的慢病毒载体感染成熟DC(未感染的DC作为阴性对照),Western Blot方法检测MSLN在DC中的表达。4 CTL细胞的获得:将负载MSLN的慢病毒感染的DC及未感染的DC分别加入从外周健康新鲜血中分离获得的人外周血单核细胞中孵育,并补充重组人IL-2,第7天收集CTL。5 LDH释放法测定CTL的功能:将DC-p BOB-1MSLN诱导产生的CTL分别与OVCAR3或SKOV3按照不同的E:T比率孵育。通过对损伤的OVCAR3或SKOV3细胞中释放的LDH测定来评价CTL对OVCAR3或SKOV3的细胞毒作用。6流式细胞术检测靶细胞凋亡率:用流式细胞术检测卵巢癌细胞凋亡率来验证CTL对OVCAR3或SKOV3的细胞毒作用。7酶联免疫吸附试验检测IFN-γ的释放量:应用酶联免疫吸附试验检测DC-p BOB-1MSLN诱导的CTL产生IFN-γ的能力,用没有转染的DC诱导产生的CTL作为对照。结果1间皮素在OVCAR3和SKOV3细胞中均有表达,其中在卵巢癌细胞株OVCAR3的表达高于SKOV3。2培养第9天成熟的显微镜下可以见到典型的成熟DC的形态。采用第三部分负载间皮素全长c DNA的DC疫苗抗卵巢癌细胞OVCAR3和流式细胞术检测成熟DC表面的CD分子抗体,结果显示,83.07%的DC细胞表达CD80,85.80%的DC细胞表达CD86,有52.42%的DC细胞表达CD83。3 Western Blot方法检测MSLN在DC中的表达。结果显示,间皮素在病毒转染的DC中表达,而在未转染的DC中不表达。4间皮素特异性CTL对这两种卵巢癌细胞的细胞毒作用随着E:T比例增高也明显升高。同时,在比例为50:1和10:1时,对OVCAR3的细胞毒性明显高于SKOV3。说明间皮素修饰过的DC诱导的CTL对OVCAR3表现出高效的间皮素特异的细胞毒性。5用流式细胞术检测卵巢癌细胞凋亡率:效应细胞CTL在完成杀伤后已大部分死亡;OVCAR3和SKOV3两种靶细胞在自然释放条件下结果OVCAR3和SKOV3细胞的自然释放凋亡率分别为23.31%和6.8%;MSLN诱导的CTL对两种靶细胞均有非常显著的诱导凋亡的作用,且随着效靶比的增高凋亡率也明显提高,并且OVCAR3细胞比SKOV3细胞凋亡率更高;未用MSLN诱导的CTL对OVCAR3和SKOV3也有一定的诱导凋亡的作用。6与对照组相比,DC-p BOB-1MSLN诱导产生的CTL释放更多的IFN-γ,两者相比,差异有显著性(P0.01)。结论1经过转染的DC检测到强烈的间皮素表达,证明转染成功,提示负载间皮素的DC疫苗将显现其高效性。2间皮素全长基因转染DC刺激产生的间皮素特异性CTL能够引发更加强大的细胞毒作用。3具有间皮素特异性的CTL比普通CTL对卵巢癌细胞系的杀伤率明显提高,表明负载间皮素的DC疫苗用于治疗卵巢上皮癌有着良好的应用价值和前景。


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