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CCNG2在人甲状腺乳头状癌K1细胞中的表达及其对K1细胞增殖凋亡影响的研究

王倩倩  
【摘要】:目的:细胞周期蛋白G2(Cyclin G2,CCNG2)是细胞周期蛋白家族中发现较晚的一员。近年来对其的研究发现,CCNG2具有抑制细胞增殖、促进凋亡,负性调控肿瘤细胞增殖的作用。本研究旨在探讨CCNG2基因在甲状腺乳头状癌K1细胞中的表达情况及其对K1细胞增殖、凋亡的影响,并期望通过实验了解CCNG2基因在上述过程中可能的作用机制,为以CCNG2为靶点的甲状腺乳头状癌治疗提供实验依据。方法:1构建载有CCNG2基因的质粒p EGFP-N1-CCNG2,优化转染条件后转染体外甲状腺乳头状癌K1细胞,Western blot法检测转染结果。2 MTT、流式细胞术分别检测空白对照组、阴性对照组、实验组K1细胞增殖、凋亡情况。Western blot法、免疫细胞化学染色法检测CCNG2、p53、mdm2蛋白表达情况。3上述实验均重复3次或以上,结果以均数±标准差(x±S)表示。计量资料行正态性检验及方差齐性检验后采用方差分析,多组数据两两比较采用LSD-t检验。所有实验数据均用SPSS17.0统计学软件进行统计学处理,P0.05为差异有统计学意义。结果:1转染条件的优化及检测:不同比例DNA与转染试剂Lipofectamine2000混合后转染细胞,各组转染效率有差异,其中DNA(ug):Lipofectamine2000(ul)为1:5时转染效率最高,达(77.33±3.79)%(P0.05);不同细胞融合度时接受转染,转染效率有差异,以细胞融合度达50~60%时转染效率最佳,为(90.33±1.53)%(P0.05)。2 MTT检测细胞增殖结果:分别于转染24h、48h、72h、96h行MTT检测,与对照组比较实验组各时间点均出现生长抑制,并于转染72小时抑制效应最明显达35.40%(P0.05),空白对照组与阴性对照组间差异无统计学意义(P0.05)。3 FCM检测细胞凋亡结果:转染48小时后,实验组较空白对照组、阴性对照组早期凋亡率明显升高[(5.48±0.35)%vs(1.06±0.05)%、(1.12±0.09)%](P0.05);实验组较空白对照组、阴性对照组晚期凋亡率显著升高[(9.90±0.94)%vs(2.65±0.20)%、(1.58±0.28)%](P0.05),空白对照组与阴性对照组比较,细胞早期、晚期凋亡率差异均无统计学意义(P0.05)。4 Western Blot检测结果:转染48小时后,实验组CCNG2蛋白相对表达量较空白对照组、阴性对照组显著升高(0.72±0.053 vs 0.36±0.032、0.37±0.040)(P0.05),而两对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。转染48小时后,实验组与对照组相比,p53、mdm2蛋白表达水平明显上调(P0.05),空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。分别转染p EGFP-N1-CCNG2 24h、48h、72h,CCNG2蛋白表达持续增加,p53、mdm2蛋白表达水平上调且与CCNG2表达趋势具有一致性。5免疫细胞化学染色法结果:转染p EGFP-N1-CCNG2 48h后实验组CCNG2、p53、mdm2蛋白表达阳性水平明显高于对照组。结论:1体外实验显示,瞬时转染技术使CCNG2基因在甲状腺乳头状癌K1细胞产生过表达并具有抑制细胞增殖,促进细胞凋亡的作用。2转染CCNG2基因后CCNG2、p53蛋白表达上调,推测CCNG2通过上调p53蛋白表达水平起到抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。3转染CCNG2基因后mdm2蛋白表达上调,推测这种现象可能为过量的p53蛋白所致,同时可能存在CCNG2对mdm2作用的其他途径,对mdm2上调的原因及其与CCNG2之间的关系做深入研究将有助于进一步了解CCNG2肿瘤负性调控作用机制。


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