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Nrf2、HO-1、VEGF在糖尿病大鼠肾脏中表达情况及莱菔硫烷对其干预作用的研究

李琳  
【摘要】:目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常见、最严重的微血管并发症之一,已成为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因之一。研究显示DN的发病机制与糖代谢紊乱、血流动力学改变、内皮细胞功能障碍、炎症、氧化应激及自噬等多种因素有关,糖尿病并发症病理学的统一机制学说的提出,充分体现了高糖诱导的氧化应激在DN发生发展中的重要作用。近年来,诱导机体细胞的自然保护反应正引起关注,即转录因子NF-E2相关的因子2(Nrf2)与其负调控蛋白Keap1共同调控的II相酶的表达,被认为是细胞抵御氧化应激的最主要途径。本研究通过建立糖尿病大鼠模型,测定肾组织中丙二醛(MDA)含量及总抗氧化能力(T-AOC)反应糖尿病大鼠肾脏氧化应激程度;应用免疫组织化学、荧光定量PCR等方法检测肾组织的Nrf2、HO-1、VEGF的表达情况;并给予II相酶诱导剂莱菔硫烷(sulforaphane,SF)进行干预,观察其对肾脏MDA、T-AOC、Nrf2、HO-1、VEGF表达影响;探讨Nrf2/ARE通路与DN氧化应激的关系以及莱菔硫烷的干预效果,旨在为糖尿病肾病的防治提供实验性理论依据。方法:清洁级健康雄性SD大鼠36只,体重200±20 g,按随机数字法分为:正常对照组(NC组)、糖尿病模型组(DM组)、药物干预组(DM+SF组),每组12只,其中DM组及DM+SF组给予腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg(溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中,PH 4.2),72 h后尾尖取血测定血糖,以血糖≥16.7 mmol/L,尿糖+++~++++,作为糖尿病模型成功的标志,NC组给予等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。实验期间动物自由进食、饮水,不使用降糖药物。DM+SF组予以SF500μg/kg(溶于植物油中),灌胃,1次/日;NC组、DM组予以等量的植物油灌胃,1次/日。分别于实验的第8周、第12周每组随机取6只大鼠称重后分别用代谢笼收集24 h尿,用于测定尿蛋白定量。心脏取血测定血糖、肌酐、尿素氮。留取肾组织标本用于制作肾皮质匀浆测定MDA及T-AOC浓度。制备病理组织切片并进行HE、PAS染色明确肾脏病理变化。应用免疫组织化学及荧光定量PCR方法检测Nrf2、HO-1、VEGF在肾脏的表达部位并对其进行定量检测。对于满足正态方差齐的数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计学处理,非正态或方差不齐时采用多个独立样本的秩和检验。P0.05表示有统计学意义。结果:1一般情况:NC组大鼠饮食及尿量无明显变化,毛发光泽,反应灵敏,体重明显增长;DM组及DM+SF组逐渐出现多饮、多尿、多食、毛发枯黄,体重相对于同期NC组大鼠明显下降(P0.05);但两时间点DM组与DM+SF组相比体重差异无统计学意义(P0.05)。2生化指标:各时间点血肌酐、尿素氮、血糖、24h尿蛋白定量DM组及DM+SF组较NC组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);DM组及DM+SF组血糖值无明显差异(P0.05);与DM组相比SF+DM组血肌酐、尿素氮、24h尿蛋白定量降低,差异具有统计学意义(P0.05)。3 MDA、T-AOC水平:DM组及DM+SF组肾皮质匀浆中MDA浓度高于NC组(P0.05),T-AOC活性小于NC组(P0.05);与DM组比较,两个时间点,DM+SF组肾皮质匀浆MDA浓度降低(P0.05),T-AOC活性增高(P0.05)。4肾脏组织HE及PAS染色:NC组大鼠肾小球结构正常,肾小管上皮细胞排列整齐,结构清晰,基底膜染色粗细均匀一致,无系膜细胞及系膜基质增多等异常改变;DM组部分肾小球体积增大,系膜细胞及基质增多,系膜区增宽,基底膜粗细不均,部分部位出现肾小管扩张,部分肾小管上皮细胞出现空泡变性,12周末上述病理改变最为突出,DM+SF组与DM组比较上述病理变化相对减轻。5免疫组织化学染色:Nrf-2、HO-1、VEGF在NC组肾脏组织少量表达;两时间点,DM组Nrf-2、HO-1、VEGF表达量较NC组相对增加;DM+SF组较DM组Nrf-2、HO-1表达增多,VEGF表达减少,差异有统计学意义(P0.05)。6荧光定量PCR:与NC组相比两时间点DM组中Nrf2、HO-1、VEGFm RNA相对表达量增加,差异有统计学意义(P0.05);DM+SF组较DM组Nrf2、HO-1m RNA表达量增加,VEGFm RNA表达量减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1糖尿病状态下,大鼠肾脏存在氧化应激,在氧化应激状态下Nrf2/ARE通路调控的抗氧化蛋白表达增多。2莱菔硫烷可以降低肾组织MDA含量,增加T-AOC的活力,诱导Nrf2及其下游的抗氧化蛋白HO-1的表达,改善糖尿病大鼠肾脏的氧化应激状态;也可通过抑制VEGF的表达来改善糖尿病时肾脏内皮细胞功能障碍。3莱菔硫烷对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用,其机制可能是通过改善肾脏氧化应激及内皮细胞功能障碍实现的。


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