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重楼皂苷Ⅰ对涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞系的增殖的影响作用及其机制

崔怡  
【摘要】:目的:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)旧称圆柱瘤或圆柱瘤型腺癌,是涎腺常见的上皮源性恶性肿瘤,没有明显的性别差异,可发生于任何年龄,但以中老年居多。SACC可发生于任何涎腺,但以腮腺、颌下腺以及腭部小涎腺居多。SACC作为恶性肿瘤,有着独特的生物学特性,其具有嗜神经侵袭生长和远处转移性,远处转移尤以肺部最为常见,其远端转移率在口腔颌面部肿瘤中居首位。SACC目前临床治疗手段仍采用以手术切除治疗为主,术后辅以放疗的综合治疗方案。但该综合治疗方案无法对局部复发以及远处转移形成有效控制,其远处转移比例在口腔颌面部居肿瘤中仍位于首位。但如今,从涎腺腺样囊性癌的发病原因、嗜神经侵袭性和远处转移的机制仍然未能研究清楚,因此探索新的治疗方法,提高对腺样囊性癌的治疗疗效,降低其局部复发和远处转移,对提高患者生存率、生存质量显得十分重要。重楼(Rhizoma Paridis)为百合科重楼属的干燥根茎,目前研究表明其具有抗炎、止血、止痛、镇静以及抗癌等作用。重楼皂苷Ⅰ(Polyphyllin I)为重楼的一种甾体皂苷类成分。近年来相继有研究显示,重楼皂苷Ⅰ有抗肿瘤的作用。但重楼皂苷Ⅰ是否有对人腺样囊性癌细胞增殖存在抑制作用,及其作用机制,国内外尚未见报道。本研究拟对体外培养的人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞进行不同浓度、不同时间重楼皂苷Ⅰ处理,观察不同浓度、不同时间的重楼皂苷Ⅰ对人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞系的增殖是否具有抑制作用,探讨其可能的作用机制,旨在为腺样囊性癌综合治疗中寻找新的并且有效的植物化学药物奠定实验基础材料与方法:1材料1.1 ACC-M由上海交通大学口腔颌面外科实验室提供,建立于1995年;1.2重楼皂苷Ⅰ(Polyphyllin I)购自成都普菲德生物技术有限公司2方法2.1药液配制重楼皂苷I用二甲基亚砜溶解配制成10mg/m L的储存液,室温下储存,使用前用RPMI1640培养液稀释。2.2细胞培养培养液采用RPMI1640加入10%的新生牛血清和青霉素-链霉素,置于37℃、5%CO2恒温箱内饱和湿度进行培养,每72-96小时传1代,采用胰蛋白酶进行消化传代。2.3 MTT比色试验取对数生长期细胞制成5.0×104个/m L细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μl,培养24h后,分别加入含重楼皂苷Ⅰ溶液200μg,使终浓度为1μg/m L、2μg/m L、4μg/m L、6μg/m L、8μg/m L、10μg/m L,并设对照组和调零孔,每组5个复孔。继续培养24、48小时后,每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μl,以及完全培养液180μl,再进行培养4h后吸去上清液,然后每孔加入200μl二甲基亚砜,于振荡器上振荡摇匀,促使结晶充分溶解,置酶标仪上测各孔吸光度值,重复三次,取均值计算生长抑制率。2.4台盼蓝拒染实验取对数生长期细胞制成5.0×104个/m L细胞悬液,接种于6孔板,每孔3ml,培养24h后,分别加入重楼皂苷Ⅰ溶液,使终浓度为2μg/m L、4μg/m L,设对照组,继续培养24、48小时后以台盼蓝染液处理,在规定时间内分别计数各浓度时间的染色细胞(即死亡细胞)与未染色细胞(即活细胞)的数量,并行统计分析。2.5倒置相差显微镜观察将细胞接种于50ml玻璃培养瓶中,倒置显微镜观察细胞在空白培养液和不同浓度含药培养液中(2μg/m L、4μg/m L),不同培养时间(24h、48h)的生长状况。2.6光镜观察将细胞以5.0×104个/m L的密度接种于6孔板中,孔中放置盖玻片,接种爬片成功后加入空白或含药培养液(2μg/m L、4μg/m L),培养不同时间(24h、48h),行Giemsa染色,置光镜观察。2.7电镜观察将细胞接种于50ml培养瓶中贴壁成功后加入空白或浓度为2μg/m L的含重楼皂苷Ⅰ培养液,处理24h后,制备电镜标本,观察正常与凋亡细胞的结构差异。2.8流式细胞术检测用空白培养液和不同浓度的含药培养液处理细胞不同时间后,以Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞,流式细胞仪检测细胞情况,并对数据进行统计分析。3统计分析所有实验重复三遍,汇总所得实验数据,应用SPSS 13.0进行统计学处理,细胞抑制率和凋亡率结果采用单因素方差分析,抑制率与处理时间、药物浓度之间的相关性采用相关分析。结果:1 MTT比色试验重楼皂苷Ⅰ对ACC-M细胞的增殖具有明显的抑制作用,最大生长抑制率可达100%。经统计学分析,各浓度用药组不同处理时间之间生长抑制率不同(P0.05),抑制作用与药物浓度和作用时间均存在正相关性。2台盼蓝拒染实验随药物浓度和作用时间的增长用药组的活细胞比例呈明显下降趋势,经统计学分析,各时间组和各浓度组之间有统计学差异(P0.05)。3倒置显微镜观察对照组细胞贴壁,并且生长迅速,多呈扁平状多角形,生长呈“铺路石”状。胞质丰满,细胞中央处可见圆形的细胞核,细胞联系紧密,细胞间隙小。用药组的细胞可见生长受到明显抑制,培养液中有悬浮细胞,而且部分贴壁的细胞变圆,体积变大,细胞间连接松解,细胞间隙变大。4光镜观察对照组细胞轮廓清晰,并且可见多个核仁;用药组细胞膜完整性遭到破坏,细胞质可见空泡样变化或崩解,细胞核出现核固缩。5电镜观察对照组细胞完整,核仁明显,细胞内各细胞器清晰可见,功能亢进,可见明显分裂象;用药组细胞表面绒毛减少或消失,细胞膜连续性遭到破坏不完整,细胞质内空泡性变,甚至崩解;线粒体致密化,细胞核被细胞质内空泡挤压向一侧。部分出现核仁消失。6流式细胞术检测对照组细胞凋亡率低,且随时间增长并无明显趋势性变化,用药组细胞凋亡率随着药物浓度的增加和作用时间的延长存在上升趋势,但统计学分析,用药组的细胞各时间组和各浓度组之间无统计学差异(P0.05)。结论:重楼皂苷Ⅰ具有抑制涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞系增殖的作用,这种增殖抑制的主要机制是由于重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性作用,并且抑制作用呈药物浓度和处理时间依赖性关联。细胞凋亡不是重楼皂苷Ⅰ抑制腺样囊性癌ACC-M细胞增殖的主要原因。


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