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丁苯酞对苯妥英钠引起的SD大鼠海马、小脑神经细胞凋亡影响的研究

刘娜  
【摘要】:目的:丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)是人工合成的消旋体,临床常用于缺血性脑血管病的治疗,对脑神经组织细胞具有保护作用。在临床上,苯妥英钠(Phenytoin sodium,PHT)常用于癫痫、心律失常、三叉神经痛等疾病,其中以抗癫痫应用最为常见;但其治疗谱狭窄,易出现神经毒性,不良反应较多,如眩晕、共济失调、言语不清等。而本实验主要研究丁苯酞对苯妥英钠作用后的大鼠海马、小脑神经细胞Bax和Bcl-2的表达,探讨苯妥英钠的毒副作用及丁苯酞的神经保护机制。方法:1分组及给药:健康的清洁级8周龄雄性SD大鼠36只,重量为(170±20g),随机分为NS(生理盐水+花生油)组、NBP(丁苯酞+生理盐水)组、PHT高剂量组、PHT低剂量组、PHT高剂量+NBP混合组和PHT低剂量+NBP混合组,每组各6只。采用自己制作的灌胃针在9:00—11:00Am进行灌胃。PHT组、NBP+PHT组中的PHT按高、低剂量分别给200mg/kg/d、100mg/kg/d,同时其它组给予等量生理盐水;NBP(用食用花生油溶解)80mg/kg,同时其它组给予等量的花生油灌胃,每天1次,共30天。2取材及检测:用10%水合氯醛(0.36ml/100g)麻醉各组大鼠,使其仰卧,并固定,剖开胸腔,暴露大鼠心脏,从心尖处插入灌注针,同时从右心耳处剪开心脏放血。先快速以0.9%生理盐水(100ml~150ml)冲洗,再用4%多聚甲醛磷酸缓冲液(200ml~300ml)固定。注射完毕后立即断头,迅速取出其大脑和小脑,放入4%的多聚甲醛固定,常规乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸腊,包埋,选取大脑和小脑连续冠状切片,片厚5μm。通过HE及尼氏染色观察各组神经细胞凋亡和变性的情况,通过免疫组化检测各组神经细胞Bax、Bcl-2蛋白阳性表达情况并以平均光密度值(AOD)表示各组结果。3统计分析:使用SPSS13.0统计软件进行数据分析,多组间均数采用One-Way ANOVA检验比较,各组均数间两两比较采用SNK检验,当Ρ0.05时,认为差异有统计学意义。结果:1 HE染色结果NS组及NBP组大鼠海马和小脑神经元排列整齐紧密,细胞结构清晰,胞浆红染胞核蓝染,胞核圆形或椭圆形,核仁清晰,形态正常,偶见几个凋亡细胞,其细胞轮廓模糊,细胞体积缩小,细胞核固缩深染,胞质嗜酸性染色增强,周围空泡形成。PHT低剂量组海马及小脑神经元排列比较稀疏,轮廓模糊,细胞核固缩深染,且周围空泡形成,凋亡细胞较多。NBP+PHT低剂量组海马及小脑神经元排列尚整齐,结构尚完整,较PHT低剂量组细胞凋亡程度轻。PHT高剂量组海马及小脑有大量凋亡细胞,其神经元细胞排列散乱,稀疏,细胞体积缩小,核不规则,大量细胞核固缩深染,胞浆嗜伊红。NBP+PHT高剂量组较PHT高剂量组海马及小脑神经细胞凋亡程度轻。2尼氏染色结果NS组及NBP组大鼠海马和小脑神经元排列规则紧密,且形态完整、核仁清晰,胞浆内尼氏体丰富,没有明显神经元丢失。与NS组和NBP组相比,PHT低剂量组和PHT高剂量组大鼠海马和小脑神经元丢失较明显,细胞分布不均,可见细胞皱缩,染色质凝集成块、核固缩、尼氏小体数量减少,其中PHT高剂量组神经元丢失更为明显。NBP+PHT低剂量组与NS组和NBP组相比,海马及小脑神经元没有明显丢失。NBP+PHT高剂量组海马及小脑神经元丢失较PHT高剂量组明显减少。3免疫组化染色结果3.1 Bax蛋白表达结果Bax蛋白的阳性表达为棕黄色或棕色颗粒,主要分布在细胞胞膜和胞浆内,细胞核不着色。NS组和NBP组海马及小脑神经细胞偶可见阳性细胞表达;NBP+PHT低剂量组(NP1组)海马及小脑神经细胞可见少量阳性细胞表达,NBP+PHT高剂量组(NP2组)海马及小脑神经细胞阳性细胞表达明显增多;PHT高剂量组(NP2组)和PHT低剂量组(NP1组)海马及小脑神经细胞可见大量的阳性细胞表达,且分布密集,胞浆呈棕黄色,染色深,其中PHT高剂量组(P2组)尤为显著。NBP组、NS组与NP1组中任意两组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。P1组、P2组、NP2组任意两组比较,其差异均具有统计学意义(P0.05):P1组Bax蛋白阳性细胞表达低于P2组(P0.05),NP2组阳性细胞表达低于P1组(P0.05),NP2组阳性细胞表达低于P2组(P0.05)。P1组与NP1组比较,其差异有统计学意义,NP1组阳性细胞表达低于P1组(P0.05)。NP1组与NP2组比较,其差异有统计学意义,NP1组阳性细胞表达低于NP2组(P0.05)。3.2各组实验大鼠Bcl-2蛋白表达Bcl-2蛋白的阳性表达为棕色颗粒,呈重染,主要分布在细胞胞浆核膜,细胞核不着色。NS组与NBP组海马及小脑神经细胞的阳性细胞表达明显;PHT低剂量组及PHT高剂量组海马及小脑神经细胞均少量表达,其中高剂量组阳性细胞表达减少更明显;NBP+PHT低剂量组海马及小脑神经细胞阳性细胞表达明显;NBP+PHT高剂量组海马及小脑神经细胞阳性细胞表达增多。NBP组、NS组与NP1组中任意两组比较,差异均无统计学意义(P0.05);P1组、P2组、NP2组任意两组比较,其差异均具有统计学意义(P0.05):P1组Bcl-2蛋白阳性细胞表达高于P2组(P0.05),NP2组阳性细胞表达高于P1组(P0.05),NP2组阳性细胞表达高于P2组(P0.05)。P1组与NP1组比较,其差异有统计学意义,且NP1组阳性细胞表达高于P1组(P0.05)。NP1组与NP2组比较,其差异有统计学意义,NP1组阳性细胞表达高于NP2组(P0.05)。结论:1不同治疗剂量PHT均可导致正常大鼠海马、小脑神经细胞凋亡,其抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达增多;其高剂量组影响更明显,呈剂量相关性。2 NBP+PHT高、低剂量组分别与PHT高、低剂量组相比海马、小脑神经细胞Bcl-2表达均增多,Bax表达均减少,细胞凋亡受到抑制。NBP可能通过提高Bcl-2的表达水平,降低Bax的表达水平,抑制细胞凋亡,起到神经保护作用。3与NBP组比较,NP1组海马、小脑神经细胞Bcl-2与Bax表达均无统计学意义;NP2组海马、小脑神经细胞Bcl-2表达减少,Bax表达增多,说明NBP可抑制低剂量PHT引起的神经细胞凋亡,不能完全抑制高剂量PHT引起的神经细胞凋亡。


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